エクソソームの半月板再生における作用機序の解明と遺伝子改変による組織再生能の増強

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ヒト滑膜由来MSCsの培養液上清から10kDaのAmicon Ultra Filter Unit（EMD Millipore, USA）を用いてMSC-EVs を精製した。精製したMSC-EVs の評価としてNanoSight LM10によるナノ粒子解析にてサイズ、形態を評価した。ウエスタンブロッティングによるEV関連マーカーの確認、透過型電子顕微鏡による外観の確認を行った。MSC-EVsの解析では、ナノ粒子解析により、MSC-EVsのサイズあは124.3nmにピークを持つ粒子群であり、ウエスタンブロッティングにより生体内微粒子関連マーカーである CD9 ,63 を発現していることが示された。透過型電子顕微鏡では100nm程度のほぼ球形の外観が確認され、MSC-EVsの解析結果は過去の報告と同様の結果であった。軟骨細胞と滑膜MSCsに対し、MSC-EVsを添加し、増殖能をCCK-8 assayによる吸光度（n=6）、遊走能をTrans well assay（n=6）、発現遺伝子（DEG）をBGISEQ-500によるRNA-seq（n=4）で評価した。In vitro実験では軟骨細胞、MSCsの増殖能、遊走能はEV群において有意な向上を認めた。RNA-seqにおいてMSC-EVs投与によって軟骨細胞で168個、MSCsで43個のDEGが同定され共通するDEGは9個であった。軟骨細胞のDEGについてKEGG経路解析を行うとMSC-EVs投与によって「Cytokine-cytokine receptor interaction」の発現が最も有意に上昇を認めた。この遺伝子セットと軟骨細胞、MSCsで共通するDEGを比較するとCXCL5とCXCL6の遺伝子セットが共通の遺伝子として同定された。