疾患iPS細胞由来腎オルガノイドの樹立による新規腎結石モデルと結石溶解療法の開発

1.健常者および尿路結石患者由来の腎オルガノイドの作製：昨年度と同様に作製したiPS細胞を、高里（Nature, 2015）らの手法を用いて、CHIR99021、FGF9の付加により腎前駆細胞へと分化させ、遠心分離による再集合の形成と三次元培養を経て腎オルガノイドを誘導した。またFreedman（Nat Commun, 2015）らの手法を用いて、CHIR99021、B27の付加により遠心分離を行なわず、Spheroidを形成させることによる腎オルガノイドの誘導も行った。作製された腎オルガノイドの評価は、いずれの手法によるものもホールマウント免疫染色にて行った。健常者由来と尿路結石患者由来の腎オルガノイドは、WTI、LTL、E-cadherinの免疫染色によって、それぞれ糸球体、近位尿細管、遠位尿細管の構造が発現していることを確認した。2.健常者および尿路結石患者由来の腎オルガノイドでの結晶形成の相違：健常者および尿路結石患者での結晶形成の相違を確認するため、それぞれの腎オルガノイドを作製する過程でCOM結晶を共培養し、腎オルガノイド内部への結晶の取り込みを試みた。作製されたそれぞれの腎オルガノイドは透過型電子顕微鏡で観察したが、尿細管内への結晶の取り込みや、結晶形成における創意を確認することはできなかった。3.尿路結石形成における遺伝因子の相違：尿路結石形成において遺伝因子の関与を検討する場合、腎オルガノイドを形成した糸球体、近位尿細管、遠位尿細管それぞれでの検討が必要になる。それぞれの細胞へと分離するためにセルソーターを使用できる環境を整備した。

1.健常者および尿路結石患者由来の腎オルガノイドの作製：昨年度と同様に作製したiPS細胞を、高里（Nature, 2015）らの手法を用いて、CHIR99021、FGF9の付加により腎前駆細胞へと分化させ、遠心分離による再集合の形成と三次元培養を経て腎オルガノイドを誘導した。またFreedman（Nat Commun, 2015）らの手法を用いて、CHIR99021、B27の付加により遠心分離を行なわず、Spheroidを形成させることによる腎オルガノイドの誘導も行った。作製された腎オルガノイドの評価は、いずれの手法によるものもホールマウント免疫染色にて行った。健常者由来と尿路結石患者由来の腎オルガノイドは、WTI、LTL、E-cadherinの免疫染色によって、それぞれ糸球体、近位尿細管、遠位尿細管の構造が発現していることを確認した。2.健常者および尿路結石患者由来の腎オルガノイドでの結晶形成の相違：健常者および尿路結石患者での結晶形成の相違を確認するため、それぞれの腎オルガノイドを作製する過程でCOM結晶を共培養し、腎オルガノイド内部への結晶の取り込みを試みた。作製されたそれぞれの腎オルガノイドは透過型電子顕微鏡で観察したが、尿細管内への結晶の取り込みや、結晶形成における創意を確認することはできなかった。3.尿路結石形成における遺伝因子の相違：尿路結石形成において遺伝因子の関与を検討する場合、腎オルガノイドを形成した糸球体、近位尿細管、遠位尿細管それぞれでの検討が必要になる。それぞれの細胞へと分離するためにセルソーターを使用できる環境を整備した。