高効率5-HT2Aレセプター発現iPS細胞の樹立と新規単離法の開発

高效表达5-HT2A受体的iPS细胞的建立及新分离方法的开发

• 批准号: 21K10028
• 负责人: 松本 貴志
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Showa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K10028/
• 关键词: 睡眠時ブラキシズム; ５－HT２A

本研究では、①効果的な5-HT2A高発現iPS細胞分化誘導法の確立あたり、(a)ブラキシズムおよび対象患者のiPS細胞の樹立、(b)iPS細胞のセロトニン分化誘導法の検討、(c)効率的な5-HT2A 高発現細胞の選択的培養法の検討、②5-HT2A高発現iPS細胞を用いたセロトニン受容体のSNP変異による受容体機能解析として、(a) 5-HT2A SNP変異による機能解析（ⅰ：生物学的アプローチ、ⅱ：電気生理学的アプローチ）と、それに付随して（b）5-HT2A変異による機能変化に影響する因子の探索を行う予定である。初年次となる2021年度は、(a)ブラキシズムの遺伝子的疾患特異モデルを確立および(b)樹立したiPS細胞について、安定したセロトニン関連遺伝子発現神経細胞への分化誘導方法について検討するため、実験遂行の準備としてポジティブコントロールおよびネガティブコントロールと成り得る分子生物学的因子の探索を行い同定した。誘導物質の濃度勾配による領域特異的神経細胞分化誘導法について検討し、比較的目的遺伝子の発現が多いとされる領域特異的な誘導を実施した。分化誘導した細胞より微弱ではあるが目的遺伝子の発現が認められた。2022年度研究では、(c)効率的な5-HT2A 高発現細胞の選択的培養法の検討として、標的遺伝子のプロモーター領域を応用した蛍光標識によるモニタリング法：5-HT2A のプロモーター領域を挿入したGFP標識ウイルスベクターを作製しiPS細胞へ感染させた。神経細胞分化誘導効率は強くはないが、蛍光顕微鏡下にて発行強度の高い細胞の選別が可能となった。また、②5-HT2A高発現iPS細胞を用いたセロトニン受容体のSNP変異による受容体機能の解析として、(a)5-HT2A SNP変異による機能解析のうち、単細胞パッチクランプ法による電気生理学的アプローチを実施し、細胞内のSNP変異による差異に関して結果を得ることができた。

This study was conducted to: (1) establish a method for inducing differentiation of 5-HT2A high-level iPS cells;(a) establish iPS cells from target patients;(b) investigate a method for inducing differentiation of iPS cells;(c) investigate a method for culturing high-level 5-HT2A high-level iPS cells;(d) analyze SNP differences in receptor functions for the use of 5-HT2A high-level iPS cells;(a) Functional analysis of 5-HT2A SNP variation (i: Approroguchi in biology, ii: Approroguchi in electrical physiology) and (b) Exploration of factors that affect functional variation in 5-HT2A variation is expected. In 2021, we will focus on (a) establishing disease-specific genes for the development of IPS-related genes, and (b) establishing methods for inducing differentiation of IPS-related genes, and exploring and determining molecular biological factors for the development of IPS-related genes. Domain-specific induction of neuronal differentiation by concentration matching of inducing substances The differentiation induced by the cell is weak, and the target cell is weak. In 2022, we studied (c) the culture method for selecting 5-HT2A high-expression cells with high efficiency, and the method for identifying target cells using fluorescent markers in the field: 5-HT2A high-expression cells with GFP markers in the field and controlling iPS cell infection. The induction rate of neural cells is high, and the selection of cells with high induction intensity under light microscope is possible. (a) Functional analysis of SNP variation in 5-HT2A receptor in iPS cells with high 5-HT2A expression; and (b) The results of the analysis of SNP variation in iPS cells with high 5-HT2A expression are related to the implementation of electrophysiological differences and differences in intracellular SNP variation.