Regulation of cell differentiation by novel autophagy regulators

KnkA, Bcas3のオートファジーと細胞分化における進化的変遷を明らかにする目的で、これまで用いたDictyostelium discoideum (Ddis)と系統の異なるPolysphondilium violaceum (Pvio) のknkA, bcas3遺伝子破壊株、P. pallidum (Ppal) knkA遺伝子破壊株を作成し表現型解析した。Ppal bcas3は遺伝子破壊とゲノム編集を繰り返し試みたが成功していない。表現型解析から、柄分化についてDdisと共通した異常が見られる一方、胞子形成には必須でないなど、Ddisとの違いも見られた。一方、マウス及びシロイヌナズナのknkA, bcas3オーソログをそれぞれのDdis遺伝子欠損株に導入したところ、予想に反し表現型の相補が見られなかった。外来タンパク質とDdis knkAまたはbcas3との相互作用に問題がある可能性を考え、DdisのknkA, bcas3二重欠損株を作成しシロイヌナズナの両遺伝子を発現させたが、依然として表現型は相補されず、他の機能分子との相互作用に種特異性があることが示唆された。また、オートファジー調節因子の分解を任意に調節する目的でオーキシン誘導デグロンタグ付加タンパク質の分解を試みたが、上手くいっていない。そこで、大腸菌のジヒドロ葉酸還元酵素(eDHFR)をデグロンとしたシステムを試みている。分化誘導シグナル、cAMPの受容体結合タンパク質を同定する目的で、Ddis cAMP受容体遺伝子に変異型BirAビオチンリガーゼを挿入した株を作成し、cAMPに応答して特異的にビオチン化されるタンパク質をウエスタンブロット解析した。条件検討の結果、多数の非特異的ビオチン化たんぱくに加えて特異的にビオチン化されたと思われるバンドが検出されている。

KnkA, Bcas3のオートファジーと細胞分化における進化的変遷を明らかにする目的で、これまで用いたDictyostelium discoideum (Ddis)と系統の異なるPolysphondilium violaceum (Pvio) のknkA, bcas3遺伝子破壊株、P. pallidum (Ppal) knkA遺伝子破壊株を作成し表現型解析した。Ppal bcas3は遺伝子破壊とゲノム編集を繰り返し試みたが成功していない。表現型解析から、柄分化についてDdisと共通した異常が見られる一方、胞子形成には必須でないなど、Ddisとの違いも見られた。一方、マウス及びシロイヌナズナのknkA, bcas3オーソログをそれぞれのDdis遺伝子欠損株に導入したところ、予想に反し表現型の相補が見られなかった。外来タンパク質とDdis knkAまたはbcas3との相互作用に問題がある可能性を考え、DdisのknkA, bcas3二重欠損株を作成しシロイヌナズナの両遺伝子を発現させたが、依然として表現型は相補されず、他の機能分子との相互作用に種特異性があることが示唆された。また、オートファジー調節因子の分解を任意に調節する目的でオーキシン誘導デグロンタグ付加タンパク質の分解を試みたが、上手くいっていない。そこで、大腸菌のジヒドロ葉酸還元酵素(eDHFR)をデグロンとしたシステムを試みている。分化誘導シグナル、cAMPの受容体結合タンパク質を同定する目的で、Ddis cAMP受容体遺伝子に変異型BirAビオチンリガーゼを挿入した株を作成し、cAMPに応答して特異的にビオチン化されるタンパク質をウエスタンブロット解析した。条件検討の結果、多数の非特異的ビオチン化たんぱくに加えて特異的にビオチン化されたと思われるバンドが検出されている。