微小管切断と新たな大腸がん機構解明

該当年度では、一昨年度に引き続き、計画の②に集中した実験を行った。計画ではケトン体を直接細胞に処理する方法以外に、がん抑制遺伝子による染色体不安定性防御の側面を解明することも目的である。この遺伝子は、ケトン体が微小管アセチル化を亢進させた前年度の結果に、２点で関係しうる。１つは、代謝の側面での機能があり、機能喪失した場合、ケトン体による染色体異数性誘導にどう影響するか。もう１点は、細胞骨格に結合する性質（微小管及び中心体）を持ち、より直接的な染色体不安定性制御効果を発揮する可能性がある。まず後者の機能に着眼、物理的な結合を証明しようと試みた。がん細胞株を用いてそこに遺伝子導入により、切断タンパクとがん抑制遺伝子２つを強制共発現した。当初がん抑制遺伝子は巨大タンパクのためか、バンドを検出できなかった。試薬会社からｃDNA発現ベクターを購入したが、長い遺伝子は、それだけで変異の入る確率が増し、変異は、そこから末端までが欠落するような産物をしばしば生成する。転写効率に関してはCMVプロモーターを使用しており、文献的には問題なかった。タグの位置を、C端からN端に移動したものを同社に作成させたが結果は変化しなかった。ウェスタンブロットは、高分子専用の転写液を使用。標的細胞を、発現に有利とされる２９３細胞に変更し、再度外来遺伝子発現を試みたところ、予想サイズ半分の産物が検出された。このため外来性発現はいったん中止した。内在性がん抑制遺伝子産物タンパクを、特異抗体を使い免疫沈降し、結合タンパクを調べる手法に変更。実績ある抗体を使用したが、沈降物に該当遺伝子産物自体が検出できず。抗体のロットのためと考えられた。しかし免疫沈降に実績あるロットは既に在庫がなく、この手法も再考が必要である。

該当年度では、一昨年度に引き続き、計画の②に集中した実験を行った。計画ではケトン体を直接細胞に処理する方法以外に、がん抑制遺伝子による染色体不安定性防御の側面を解明することも目的である。この遺伝子は、ケトン体が微小管アセチル化を亢進させた前年度の結果に、２点で関係しうる。１つは、代謝の側面での機能があり、機能喪失した場合、ケトン体による染色体異数性誘導にどう影響するか。もう１点は、細胞骨格に結合する性質（微小管及び中心体）を持ち、より直接的な染色体不安定性制御効果を発揮する可能性がある。まず後者の機能に着眼、物理的な結合を証明しようと試みた。がん細胞株を用いてそこに遺伝子導入により、切断タンパクとがん抑制遺伝子２つを強制共発現した。当初がん抑制遺伝子は巨大タンパクのためか、バンドを検出できなかった。試薬会社からｃDNA発現ベクターを購入したが、長い遺伝子は、それだけで変異の入る確率が増し、変異は、そこから末端までが欠落するような産物をしばしば生成する。転写効率に関してはCMVプロモーターを使用しており、文献的には問題なかった。タグの位置を、C端からN端に移動したものを同社に作成させたが結果は変化しなかった。ウェスタンブロットは、高分子専用の転写液を使用。標的細胞を、発現に有利とされる２９３細胞に変更し、再度外来遺伝子発現を試みたところ、予想サイズ半分の産物が検出された。このため外来性発現はいったん中止した。内在性がん抑制遺伝子産物タンパクを、特異抗体を使い免疫沈降し、結合タンパクを調べる手法に変更。実績ある抗体を使用したが、沈降物に該当遺伝子産物自体が検出できず。抗体のロットのためと考えられた。しかし免疫沈降に実績あるロットは既に在庫がなく、この手法も再考が必要である。