口腔・腸内細菌と濾胞性ヘルパーT細胞を標的とした自己免疫性肝炎の病態解明

AIHマウスモデル作成：メスC57BL/6マウスの肝臓から精製したS-100抗原タンパク（0.5-2mg/mLを0.5mL）とcomplete Freund’s adjuvant(CFA、0.5mL)をメスC57BL/6マウスにday0、day7に腹腔内投与し、4週間後に慢性肝炎を発症しAIHマウスモデルを作成。いずれのAIHモデルも頬静脈採血、麻酔として混合薬（ドミトール0.15ml/ドルミカム0.8ml/ベトルファール1ml、100μl/10g BW）を腹腔内投与して心採血、頸椎脱臼で安楽死させたのちに、肝臓を採取する。 血漿のALT、IgG、抗核抗体、また肝組織をHematoxylin Eosin染色とAzan染色で評価しAIHモデルとなっているか確認する。ALTの上昇や肝組織の炎症が弱いので繰り返しモデル作成を試みる。AIHマウスモデルに抗菌薬[オートクレーブ水1Lで1g/Lアンピシリン1g/L、ネオマイシン1g/L、バンコマイシン0.5g/L、メトロニダゾール1g/L、甘味料（Sweetener Sweet’n Low、サッカリン）60g/Lを溶解し、100mL/ボトルを週2回置き換える]の飲料水経由で7日間腸管除菌する。PBSで希釈した口腔細菌1x108CFU/200μl（Veillonella dispar：株式会社KACから購入）を経口ゾンデを用いて経口投与し、4週間後に、頬静脈採血し、麻酔として混合薬（ドミトール0.15ml/ドルミカム0.8ml/ベトルファール1ml、100μl/10g BW）を腹腔内投与して心採血、その後頸椎脱臼で安楽死させ、肝臓、腸管、便を採取する。その後次世代シーケンサ・アンプリコン解析を用いてマウス便の腸内細菌叢の変化、肝組織をHematoxylin Eosin染色とAzan染色を用いて肝炎発症や重症化、軽減の有無を確認する。今後、AIHマウスモデルにFITC-dextranを用いて腸管透過性を評価する.AIHマウスモデルから腸管, 肝臓を摘出し, フローサイトメトリーや免疫染色でTfh細胞の数や浸潤程度, 機能を解析する.

AIHマウスモデル作成：メスC57BL/6マウスの肝臓から精製したS-100抗原タンパク（0.5-2mg/mLを0.5mL）とcomplete Freund’s adjuvant(CFA、0.5mL)をメスC57BL/6マウスにday0、day7に腹腔内投与し、4週間後に慢性肝炎を発症しAIHマウスモデルを作成。いずれのAIHモデルも頬静脈採血、麻酔として混合薬（ドミトール0.15ml/ドルミカム0.8ml/ベトルファール1ml、100μl/10g BW）を腹腔内投与して心採血、頸椎脱臼で安楽死させたのちに、肝臓を採取する。 血漿のALT、IgG、抗核抗体、また肝組織をHematoxylin Eosin染色とAzan染色で評価しAIHモデルとなっているか確認する。ALTの上昇や肝組織の炎症が弱いので繰り返しモデル作成を試みる。AIHマウスモデルに抗菌薬[オートクレーブ水1Lで1g/Lアンピシリン1g/L、ネオマイシン1g/L、バンコマイシン0.5g/L、メトロニダゾール1g/L、甘味料（Sweetener Sweet’n Low、サッカリン）60g/Lを溶解し、100mL/ボトルを週2回置き換える]の飲料水経由で7日間腸管除菌する。PBSで希釈した口腔細菌1x108CFU/200μl（Veillonella dispar：株式会社KACから購入）を経口ゾンデを用いて経口投与し、4週間後に、頬静脈採血し、麻酔として混合薬（ドミトール0.15ml/ドルミカム0.8ml/ベトルファール1ml、100μl/10g BW）を腹腔内投与して心採血、その後頸椎脱臼で安楽死させ、肝臓、腸管、便を採取する。その後次世代シーケンサ・アンプリコン解析を用いてマウス便の腸内細菌叢の変化、肝組織をHematoxylin Eosin染色とAzan染色を用いて肝炎発症や重症化、軽減の有無を確認する。今後、AIHマウスモデルにFITC-dextranを用いて腸管透過性を評価する.AIHマウスモデルから腸管, 肝臓を摘出し, フローサイトメトリーや免疫染色でTfh細胞の数や浸潤程度, 機能を解析する.