口腔・腸内細菌と濾胞性ヘルパーT細胞を標的とした自己免疫性肝炎の病態解明

阐明针对口腔/肠道细菌和滤泡辅助 T 细胞的自身免疫性肝炎的病理学

• 批准号: 20K08290
• 负责人: 阿部 和道
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Fukushima Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K08290/
• 关键词: 自己免疫性肝炎; 腸内細菌叢; Veillonella dispar; Tfh細胞; 口腔・腸内細菌叢; 濾胞性ヘルパーT細胞; Veillonella; 口腔・腸内細菌

AIHマウスモデル作成：メスC57BL/6マウスの肝臓から精製したS-100抗原タンパク（0.5-2mg/mLを0.5mL）とcomplete Freund’s adjuvant(CFA、0.5mL)をメスC57BL/6マウスにday0、day7に腹腔内投与し、4週間後に慢性肝炎を発症しAIHマウスモデルを作成。いずれのAIHモデルも頬静脈採血、麻酔として混合薬（ドミトール0.15ml/ドルミカム0.8ml/ベトルファール1ml、100μl/10g BW）を腹腔内投与して心採血、頸椎脱臼で安楽死させたのちに、肝臓を採取する。 血漿のALT、IgG、抗核抗体、また肝組織をHematoxylin Eosin染色とAzan染色で評価しAIHモデルとなっているか確認する。ALTの上昇や肝組織の炎症が弱いので繰り返しモデル作成を試みる。AIHマウスモデルに抗菌薬[オートクレーブ水1Lで1g/Lアンピシリン1g/L、ネオマイシン1g/L、バンコマイシン0.5g/L、メトロニダゾール1g/L、甘味料（Sweetener Sweet’n Low、サッカリン）60g/Lを溶解し、100mL/ボトルを週2回置き換える]の飲料水経由で7日間腸管除菌する。PBSで希釈した口腔細菌1x108CFU/200μl（Veillonella dispar：株式会社KACから購入）を経口ゾンデを用いて経口投与し、4週間後に、頬静脈採血し、麻酔として混合薬（ドミトール0.15ml/ドルミカム0.8ml/ベトルファール1ml、100μl/10g BW）を腹腔内投与して心採血、その後頸椎脱臼で安楽死させ、肝臓、腸管、便を採取する。その後次世代シーケンサ・アンプリコン解析を用いてマウス便の腸内細菌叢の変化、肝組織をHematoxylin Eosin染色とAzan染色を用いて肝炎発症や重症化、軽減の有無を確認する。今後、AIHマウスモデルにFITC-dextranを用いて腸管透過性を評価する.AIHマウスモデルから腸管, 肝臓を摘出し, フローサイトメトリーや免疫染色でTfh細胞の数や浸潤程度, 機能を解析する.

AIH is made up of C57BL/6 was administered intraperitoneally on day0 and day7 and 4 weeks after chronic hepatitis onset, S-100 antigen was purified (0.5-2mg/mL 0.5 mL) and complete Freund's adjuvant(CFA, 0.5 mL). In the middle of the abdominal cavity, the mixture of AIH and buccal vein blood sampling and anesthesia (0.15ml/day 0.8ml/day 1ml, 100μl/10g BW) was administered to the heart, cervical dislocation, and liver. ALT, IgG, ANAb in plasma, Hematoxylin Eosin staining and Azan staining in liver tissue were used to evaluate AIH. ALT increased and inflammation of liver tissue decreased. AIH PBS was used to collect oral bacteria 1 x 108CFU/200μl (Veillonella dispar: purchased by KAC Co., Ltd.). After 4 weeks, buccal vein blood samples were collected. The mixture of anesthetics (0.15ml/ml/ml, 100μl/10g BW) was administered intraperitoneally. Cardiac blood samples were collected from the posterior cervical spine, and liver, intestine and feces were collected. In the next generation of hepatitis, the presence or absence of changes in intestinal bacterial flora and liver tissue was confirmed by Hematoxylin Eosin staining and Azan staining. In the future, AIH can be used to evaluate intestinal permeability.AIH can be used to evaluate intestinal permeability, liver permeability, immune staining, Tfh cell number, infiltration degree and function analysis.