Analysis of the regulation mechanism of CHK1 by Mule during myocardial stress response

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本年度はMuleやその基質における糖化ストレス応答を調べた。高血糖状態や条件下では、グルコース、グルコースの代謝中間体やその分解物などが細胞内蛋白質と非酵素的に結合して終末糖化産物（AGEs）が生成される。様々なAGEsのうち、フルクトースおよびグルコース代謝の中間体であるグリセルアルデヒド（GA）由来のAGEs (TAGE) は強い細胞毒性を示し、その細胞内蓄積は心筋細胞や心線維芽細胞を含め、様々な細胞死を誘導することが過去に報告されている。今回、GA投与によってCHK1凝集体の蓄積が観察され、CHK1がTAGE修飾の標的となり、その機能を喪失することが細胞死を誘導する一因である可能性が考えられた。一方、GA刺激によるCHK1変異体の分解には、Muleのノックダウンによる効果は認められず、凝集体形成も抑制しなかった。したがって、CHK1変異体の糖化刺激に依存した分解機構にはMuleは関与しないと考えられた。驚いたことに、MuleもGAによる糖化刺激の影響を大きく受けることが今回明らかとなった。GA投与によるMuleの減少が、その迅速な分解の結果であるのか、それとも糖化したMuleが高分子複合体を形成した結果、消失したように見えるのかは明らかにできなかった。その理由は、Muleが約460kDaという巨大な蛋白質であるために、Muleが糖化によって分子間架橋を形成し始めると、1000kDaを超えるサイズとなるため、通常のウェスタンブロット解析においては、このような高分子蛋白質のPVDFメンブレンへの転写効率が極端に低下してしまうためである。Muleのような巨大なユビキチンリガーゼには、糖化修飾のターゲットとなるリジンやアルギニン残基が豊富に存在するために、その修飾を受けやすいと考えられるが、MuleのGAによる糖化修飾の影響に関しては今後さらに詳細な解析が必要である。