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自己免疫性腎炎の病態に関係する細胞表面上の自己抗原複合体の解析

自身免疫性肾炎病理相关细胞表面自身抗原复合物分析

基本信息

批准号：
20K08622
负责人：
三浦惠二
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Fujita Health University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

研究課題１および２年度の目標としては、全身性エリテマトーデス（SLE）の患者で腎炎症状（ループス腎炎）を呈する患者を対象に、我々が開発したCSP-ELISAを用いた抗血管内皮細胞抗体（AECA）の測定で強陽性となる患者を特定し、その患者血清を用いて細胞表面上の標的自己抗原の同定を行うことであった。ループス腎炎患者１４例の血清を用いてCSP-ELISAでAECAを測定したところ、３例の強陽性となる患者を特定し、その血清を用いて免疫沈降実験を行った。まず、血清からMelon Gel IgG Purification Kitを使用してIgGを精製した。その後、Dynabeads epoxyビーズにIgGを固相化し、そこに臍帯静脈血管内皮細胞（HUVEC）由来の膜タンパク可溶化画分を反応させ、洗浄後、IgGに結合しているタンパク質を回収した。その試料をSDS-PAGEで分離し、銀染色およびNeutrAvidin-HRPを用いてビオチン化されているタンパクを検出した。HUVECから調製した膜タンパク画分は、予め細胞表面タンパクをビオチン化しているため、ビオチン化が確認されると、それは細胞表面に存在していたことが確認できるためである。免疫沈降実験の結果では、還元条件で、60kDaおよび110kDa, 120kDa付近に患者特異的なビオチン化されているバンドが確認できた。しかし、銀染色では微かなバンドが確認された程度であった。質量分析で確実なシグナルを得るためには、銀染色ではっきりとしたバンドが確認できることが必須であるため、免疫沈降の条件検討を行っている。またこれまでの膜タンパク調製法では細胞の破砕と膜タンパクの回収率に振れが大きく、調製法に問題があることが判明したため、超音波処理も含めて調製法の確認を行っている。

The purpose of this study is to develop a CSP-ELISA for the determination of anti-endothelial cell antibodies (AECA) in patients with systemic lupus erythematosus (SLE) and the identification of their own antigens on the surface of cells. The serum of 14 patients with nephritis was detected by CSP-ELISA, and the serum of 3 patients with strong positive was detected by immunosedimentation. Use of Melon Gel IgG Purification Kit After that, Dynabeads epoxy coating was used to immobilize IgG, and after washing, IgG was bound to HUVEC. The samples were separated by SDS-PAGE, silver staining and NeutrAvidin-HRP. HUVEC modulation and cell surface identification The results of immunoprecipitation were confirmed by the presence of 60kDa and 110kDa, 120kDa proteins near the patient. The silver stain is slightly different from the silver stain. Quality analysis was conducted to confirm the results of silver staining. The membrane modulation method is used to determine the cell breakdown, membrane recovery rate, vibration, modulation method, ultrasonic treatment, and modulation method.