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β3インテグリン遺伝子導入ヒト表皮角化細胞を用いた難治性潰瘍に対する新規再生医療

使用β3整合素基因转移的人表皮角质形成细胞治疗顽固性溃疡的新型再生医学

基本信息

批准号：
20K09847
负责人：
久保美代子
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

難治性潰瘍部には変性コラーゲン（gelatin: GEL）も多く局在する。本年度はGEL上での正常ヒト表皮角化細胞（NHK）とαvβ3発現HKのin vitro細胞増殖について調べた。96 well plateを用いて、4日間の細胞増殖アッセイ(CCK-8 assay)を行った。Sigma社製gelatin (豚皮膚、type A)を2種類の方法：(a)オートクレーブ法（121℃、20分）、(b)煮沸法（50℃、20分）で調整し、種々の濃度(0-20,000 μg/ml)のGEL上でNHKとαvβ3発現HKとを培養した。無血清・低Ca 培地（KGM-Gold BulletKit、Ca濃度: 0.1 mM)を使用した。その結果、NHKの細胞増殖は、両GELともその低濃度 (10-100μg/ml)で著明に減少した。そしてオートクレーブ法での高濃度GEL (1,000-20,000μg/ml) でNHKの細胞増殖の増加はごく軽度であったが、煮沸法での高濃度GEL（1,000-20,000μg/ml）ではNHKの細胞増殖が著明に増加し、αvβ3発現HKのそれと同じ程度であった。またαvβ3発現HKの細胞増殖はNHKに比べて煮沸法での高濃度GEL上でのそれを除くすべてで有意に増加した(Student's t-test: p<0.0001) 。同アッセイ後の細胞形態については細胞増殖が抑制されたNHK（両GELとも10-100μg/ml）で細胞伸展が著明に減少した。加えて、同NHKではF-actin、vinculin分布の著明な減少があった。また、αvβ3発現HKではNHKに比べてフィブロネクチン分布が増加した。さらに、煮沸法GEL高濃度（10,000μg/ml）においてαvβ3発現HKでα5、β3インテグリン発現の増加、NHKでα5インテグリン発現の増加があった。

Refractory ulcer department: gelatin: GEL This year, normal epidermal keratinocytes (NHK) and αvβ3 appeared on the GEL. 96-well plate is used for cell proliferation in 4 days (CCK-8 assay). There are 2 types of gelatin (dolphin skin, type A) produced by Sigma: (a) the Otto Kulirab method (121℃, 20 minutes), and (b) the boiling method (50℃, 20 minutes). NHK and αvβ3 are produced and cultured on GEL with adjusted seed concentration (0-20,000 μg/ml). Serum-free·Low Ca medium (KGM-Gold Bulletin Kit, Ca concentration: 0.1 mM) was used. As a result, NHK's cell proliferation was significantly reduced at low concentrations (10-100μg/ml) of EL. High concentrations of GEL (1,000 - 20,000 μ g/ml) in the boiling method increased the cell proliferation of NHK, and αvβ3 in the boiling method increased the cell proliferation of NHK. Cell proliferation of αvβ3-positive HK cells was significantly higher than that of NHK cells at higher concentrations of GEL by boiling (Student's t-test: p<0.0001). Cell growth was inhibited by NHK (10-100μg/ml) and cell expansion was significantly reduced. Add, same NHK F-actin, vinculin distribution The distribution of αvβ3 in HK is increasing compared with NHK. In addition, the boiling method GEL high concentration (10,000μg/ml) caused the increase of αvβ3 generation in HK, α5 and β3 generation in NHK, and α5 generation in NHK.