相同組換えによる照射線傷害の修復とその失敗で起きる二次的な二重鎖切断部位の解明

この研究は、『相同組換え』の後半部分のメカニズムを解明することと、その修復の失敗が原因となって二次的に生じる二重鎖切断の発生部位を解明することの２つを目標としている。相同組換えの後半部分のメカニズムに関しては、計画通り、RAD54タンパク質が、RAD51タンパク質をDNAから乖離させることを示すデータを取得できた。さらに、この状態のDNA-タンパク質複合体に組み換え中間体を解消させる酵素（Holliday junction resolvase）を添加すると、相同組換えの中間体を解消できることを試験管内で実現することができた。これは本研究計画で達成目標としていたことなので、それを実現できる目処が見えてきた。現在、RAD54Bタンパク質を用いて同様な検証を行なっており、それに成功したら、RAD54、および、RAD54Bタンパク質が相同組換えの中間体構造の解消に重要な役割を担っていることを示す論文を投稿することができる。一方、相同組換えの失敗が原因となって二次的に生じる二重鎖切断の発生部位を解析については、パルスフィールド電気泳動で二重鎖切断を分離し、そのゲルからDNAを回収して、その末端部分の塩基配列を網羅的に解析する計画である。こちらに関しては、パルスフィールド電気泳動から二重鎖切断が起きたDNAの断片を回収するところまで成功した。後は、回収したDNAの末端部分の配列を決定する手法を開発するだけだが、この手法の特異性、再現性を担保するための証明が難しく、難航している。次年度は、この部分の精度を高める研究を行っていきたい。

この研究は、『相同組換え』の後半部分のメカニズムを解明することと、その修復の失敗が原因となって二次的に生じる二重鎖切断の発生部位を解明することの２つを目標としている。相同組換えの後半部分のメカニズムに関しては、計画通り、RAD54タンパク質が、RAD51タンパク質をDNAから乖離させることを示すデータを取得できた。さらに、この状態のDNA-タンパク質複合体に組み換え中間体を解消させる酵素（Holliday junction resolvase）を添加すると、相同組換えの中間体を解消できることを試験管内で実現することができた。これは本研究計画で達成目標としていたことなので、それを実現できる目処が見えてきた。現在、RAD54Bタンパク質を用いて同様な検証を行なっており、それに成功したら、RAD54、および、RAD54Bタンパク質が相同組換えの中間体構造の解消に重要な役割を担っていることを示す論文を投稿することができる。一方、相同組換えの失敗が原因となって二次的に生じる二重鎖切断の発生部位を解析については、パルスフィールド電気泳動で二重鎖切断を分離し、そのゲルからDNAを回収して、その末端部分の塩基配列を網羅的に解析する計画である。こちらに関しては、パルスフィールド電気泳動から二重鎖切断が起きたDNAの断片を回収するところまで成功した。後は、回収したDNAの末端部分の配列を決定する手法を開発するだけだが、この手法の特異性、再現性を担保するための証明が難しく、難航している。次年度は、この部分の精度を高める研究を行っていきたい。