Exploring new functions of DNA polymerase zeta using plant-cell systems

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DNAポリメラーゼζ(Polζ)を欠損したシロイヌナズナの変異体(rev3-1)は放射線に対して感受性を示すことから、植物のPolζがDNA二重鎖切断修復に関与していることが示唆されているが、その証拠は得られていない。本研究ではシロイヌナズナおよびヒメツリガネゴケを材料に用いてPolζの新規機能の探索を行うことを目的としている。R4年度は、ヒメツリガネゴケのDNA二重鎖切断修復に関わる経路の解析と、シロイヌナズナPolζの小サブユニットであるREV7とGFPとの融合タンパク質を発現する形質転換植物の作成を行った。1) ヒメツリガネゴケでは相同組換えに必須なRAD51Bを欠損すると放射線抵抗性が大きく下がることがわかっている。今回、RAD51Bに加えオルタナティブエンドジョイニング(alt-EJ)に関わるPOLQを欠損させた二重変異体のガンマ線に対する感受性を解析したところ、RAD51B単独変異よりもさらに放射線抵抗性が低下することがわかった。2) APRT遺伝子座をマーカーとして用いた変異スペクトル解析では、RAD51Bを欠損すると繰り返しを含む欠失・挿入変異が多く検出されている。今回、RAD51BとPOLQの二重欠損変異体の変異スペクトルを解析したところ、通常のPCRでは捕捉できない大きな構造変化が頻繁に生じることがわかった。このことから、ヒメツリガネゴケのDNA二本鎖切断修復では相同組換えに次いでalt-EJが重要なことが示唆された。3) Polζの新規機能を解明する目的でPolζの小サブユニットであるREV7とGFPとの融合タンパク質を発現するコンストラクトをREV7欠損株に導入し、rev7バックグラウンドの指標であるマイトマイシンC感受性が相補されることを確認した。また、蛍光顕微鏡による観察でGFP融合タンパク質がシロイヌナズナ細胞の核及び細胞質で発現することを確認した。