Development of an optogenetic tool for reguating proteins expression

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PUM-PSDの開発において以下の項目を確認した。蛍光タンパク質とタンパク質分解阻害剤を用いて、オルニチンデカルボキシラーゼのC 末端領域(cODC)をC末端に付加することにより，酵母において蛍光タンパク質の分解が誘導され、半減期が短縮することを確認した。次に、AtLOV2とcODCを融合した感光性デグロン(PSD)を作製し、同蛍光タンパク質のC末端へ融合し、酵母においてのPSDの光応答性を確認した。PSDの融合による蛍光タンパク質の半減期の減少は見られず、青色光照射下においてはじめて蛍光タンパク質の分解が観察された。しかし、PSDを直接融合させたものに比べ半減期は長く、著しいタンパク質の分解には長時間の光照射が必要であることが解った。長時間の光照射により細胞へダメージが生じるため、PSD効率の改善を試みた。AtLOV2に代わり、AsLOV2の変異体AsLOV2iLID A146ΔとcODCを融合したPSD3はPSDに比べ光応答が早く、融合タンパク質の安定性もやや高まることが文献より報告されていたため、改善策としてPSD3を新たに作製し、前述の実験を行った。その結果、蛍光タンパク質の半減期はPSDを用いたものに比べ短縮した。該当PSD3を野生型PUM-HDのC末端に融合してHEK293細胞に発現し、青色光照射によるPUM-HDの半減期を測定したところ、PUM-HDの分解は見られなかった。そのため、PSD3は酵母では機能するが、動物細胞では機能しないことを疑っている。参考文献より、青色光応答性デグロン LOV24は動物や動物細胞（ゼブラフィッシュ、NIH3T3細胞）で機能することが確認されているため、LOV24をPSD3に代わってPUM-HDに融合させ、HEK293細胞やNIH3T3細胞を用いて実験を行っている。