肺線維化病態における血漿中ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ＤＮＡの探索研究

肺纤维化病理中血浆细胞游离DNA的探索性研究

• 批准号: 20K17199
• 负责人: 猪俣 稔
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Nippon Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K17199/
• 关键词: 特発性肺線維症; cell free DNA; C57BL/6マウス; ブレオマイシン

Human foetal lung fibroblast(HFL-1)においてSYBR Gold(Thermo Fisher Scientific)を用いてcfDNAの定量解析を行った。HFL-1の培養液中cfDNAは606.7 ng/mLであり、TGF-β 10 ng/mL投与後の培養液中cDNAは1179.4 ng/mLまで上昇し、TGF-β刺激によりcfDNAが上昇することが確認された。C57BL/6マウスにブレオマイシン（BLM）をosmotic pumpで100mg/kg投与しBLM誘発肺線維症モデルマウスを作製した。BLM投与後1週間のマウスに加え、BLM非投与マウス(normal control：NC)をそれぞれサクリファイスし、採取した血液を2000×g、10分間で遠心分離し血清を採取した。NucleoSpin cfDNA XSを用いて血清からcell free DNA(cdDNA)を抽出した。その後Quanti-iTTM ds DNA Assay kit、PicoGreenを用いてcfDNAを定量した。cfDNA中央値はNC群で16112.5 ng/μL、BLM群で16064.6 ng/μLであった。A549とHFL-1をraptinalを用いて培養し上清をNucleoSpin cfDNA XSを用いてcdDNAを抽出し、cfDNAサイズの分布を解析するためバイオアナライザーで解析したところ160bp付近でピークが見られた。またBLM誘発肺線維症モデルマウス血清由来のcfDNAを用いてバイオアナライザーを用いて解析を行ったところ、BLM群で160bp 付近にピークが見られた。

Human foetal lung fibroblast(HFL-1) is used in SYBR Gold(Thermo Fisher Scientific) for quantitative analysis of cfDNA. cfDNA in HFL-1 medium was 606.7 ng/mL, cDNA in TGF-β medium was 1179.4 ng/mL and cfDNA in TGF-β medium was 10 ng/mL. C57BL/6 was administered at a dose of 100mg/kg at an osmotic pump to induce lung disease. BLM injection and 1 week after the addition of BLM non-injection and (normal control: NC), the use of blood 2000×g, 10 minutes to isolate the serum NucleoSpin cfDNA XS is extracted from the serum. Quanti-iTTM ds DNA Assay kit, PicoGreen, cfDNA quantification cfDNA central values were 16112.5 ng/μL for NC group and 16064.6 ng/μL for BLM group. A549 and HFL-1 raptinal were used in culture, supernatant, cfDNA XS, cfDNA extraction, cfDNA distribution analysis, and 160bp raptinal analysis. BLM induces lung disease, serum origin, cfDNA, and BLM group 160bp.