肺線維化病態における血漿中ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ＤＮＡの探索研究

肺纤维化病理中血浆细胞游离DNA的探索性研究

• 批准号: 20K17199
• 负责人: 猪俣 稔
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Nippon Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K17199/
• 关键词: 特発性肺線維症; cell free DNA; C57BL/6マウス; ブレオマイシン

Human foetal lung fibroblast(HFL-1)においてSYBR Gold(Thermo Fisher Scientific)を用いてcfDNAの定量解析を行った。HFL-1の培養液中cfDNAは606.7 ng/mLであり、TGF-β 10 ng/mL投与後の培養液中cDNAは1179.4 ng/mLまで上昇し、TGF-β刺激によりcfDNAが上昇することが確認された。C57BL/6マウスにブレオマイシン（BLM）をosmotic pumpで100mg/kg投与しBLM誘発肺線維症モデルマウスを作製した。BLM投与後1週間のマウスに加え、BLM非投与マウス(normal control：NC)をそれぞれサクリファイスし、採取した血液を2000×g、10分間で遠心分離し血清を採取した。NucleoSpin cfDNA XSを用いて血清からcell free DNA(cdDNA)を抽出した。その後Quanti-iTTM ds DNA Assay kit、PicoGreenを用いてcfDNAを定量した。cfDNA中央値はNC群で16112.5 ng/μL、BLM群で16064.6 ng/μLであった。A549とHFL-1をraptinalを用いて培養し上清をNucleoSpin cfDNA XSを用いてcdDNAを抽出し、cfDNAサイズの分布を解析するためバイオアナライザーで解析したところ160bp付近でピークが見られた。またBLM誘発肺線維症モデルマウス血清由来のcfDNAを用いてバイオアナライザーを用いて解析を行ったところ、BLM群で160bp 付近にピークが見られた。

Human foetal lung fibroblast(HFL-1)にお にお てSYBR Gold(Thermo Fisher Scientific)を quantitative analysis of を lines った using <s:1> てcfDNA <e:1>. の HFL - 1 medium, cfDNA は 606.7 ng/mL で あ り, TGF - beta の medium, after 10 ng/mL cast with cDNA は 1179.4 ng/mL ま で rise し, TGF - beta stimulus に よ り cfDNA が rise す る こ と が confirm さ れ た. C57BL / 6 マ ウ ス に ブ レ オ マ イ シ ン (BLM) を osmotic pump で cast with 100 mg/kg し BLM induced 発 lung line d disease モ デ ル マ ウ ス を cropping し た. Cast BLM and 1 week after の マ ウ ス に え, BLM cast and マ ウ ス (normal control: NC) を そ れ ぞ れ サ ク リ フ ァ イ ス し, take し た blood を 2000 x g, 10 points between で telecentric separation し serum を take し た. The NucleoSpin cfDNA XSを was extracted from the を て serum らcell free DNA(cdDNA)を. Youdaoplaceholder0 after そ, Quanti-iTTM ds DNA Assay kit, PicoGreenを quantified た with てcfDNAを. The central values of cfDNA are で NC group で16112.5 ng/μL and BLM group で16064.6 ng/μLであった. A549 と HFL - 1 を raptinal を with い て cultivate し supernatant を NucleoSpin cfDNA XS を with い て cdDNA を spare し, cfDNA サ イ ズ の distribution を parsing す る た め バ イ オ ア ナ ラ イ ザ ー で parsing し た と こ ろ pay nearly 160 bp で ピ ー ク が see ら れ た. ま た BLM induced 発 lung line d disease モ デ ル マ ウ ス serum origin の cfDNA を with い て バ イ オ ア ナ ラ イ ザ ー を with い analytical line を っ て た と こ ろ, BLM group で pay nearly 160 bp に ピ ー ク が see ら れ た.