Development of precise genome editing technology without genetic transformation or tissue culture in conifer species.

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我々は膜透過性ペプチド「ポリヒスチジン」を用いて、スギ細胞へゲノム編集タンパク質（以下、RNP）を導入し、標的領域の塩基配列の改変に成功している。この手法を茎頂分裂組織に適用し、遺伝子組換え・組織培養不要でゲノム編集個体を得る「in planta直接ゲノム編集法」を確立することが本課題の目的である。本年度は（1）茎頂分裂組織へのRNP導入条件の検討、（2）ゲノム編集効率を向上させる物理的・化学的処理の検討、（3）スギやカラマツのマイクロプロパゲーション方法の確立、（4）カラマツにおける組織培養系の構築について実施した。（1）茎頂分裂組織のL2層（植物体に成長する細胞層）にRNPを送達する前処理として、茎頂組織の致傷処理を検討した。スギおよびカラマツ不定胚の茎頂に一文字または十文字にメスを入れる、また不定胚を長軸方向に半分に割る半割という処理について、不定胚の生存率を調査した。一文字処理では、スギで85.7%、カラマツで88.9%の不定胚が正常に生育した。十文字処理ではスギで100%、カラマツで87.5%、そして、半割りにおいてスギでは35.7%、カラマツでは62.5%という生存率をそれぞれ示した。RNP導入時には十文字処理、または半割処理が有効と推察された。（2）ある界面活性剤を低濃度添加することで、スギ培養細胞でのゲノム編集効率の向上が確認された。（3）無菌培養スギの頂芽を断頭することで複数の茎頂組織の誘導に成功した。また、培地中に植物ホルモンを添加することで、培地設置面から茎頂組織が誘導されるのを確認した。双方とも1-2ヶ月という短期間のうちに茎頂組織が誘導される方法であり、茎頂組織の安定供給に寄与できるものと判断した。（4）カラマツにおいて、胚を露出させた未成熟種子を供試材料とすることで、高率的に未熟胚由来の培養細胞を誘導できる培養系の開発に成功した。