Verification of "rotation model" of bacterial flagellar rotor with single-molecule analysis

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ビブリオ属菌由来のNaイオン駆動型PomABを用い、完全な複合体の効率的な精製と１分子計測に必要なタグの導入の検討に取り組んだ。初めに、PomAのC末に精製用His10タグ、PomBのN末付近のIDR領域に金ナノ粒子プローブ結合用Spy-tagを挿入したコンストラクトを試みたが、PomBの発現量が低く、PomAB複合体の精製は困難であった。次に、PomAのC末にHis10タグのみを導入したコンストラクトで詳細に検討し、PomAに導入したタグで精製すると、PomBを含まないPomAのみの複合体の混入が多くなることが判明した。そこで、PomBに精製用タグを導入したコンストラクトを作製して検討を行った。その結果、PomAのC末にHis10タグ、PomBのC末にStrepTagIIを導入したコンストラクトでStrepTagIIを用いて精製を行うことで、PomAとPomBの化学量論比の大幅な改善を達成した。また、１分子計測の予備実験として、精製PomAB複合体のHis10タグによるNi-NTA修飾ガラス基板への特異的固定、およびStreptactinコート金ナノ粒子の特異的結合の有無を検証した。その結果、PomAB複合体の濃度依存的に、金ナノ粒子のガラス基板への結合数が増加することが確認された。他方、結合の絶対数はポジティブコントロールとして用いたHisタグビオチン化VoV1とストレプトアビジン修飾金ナノ粒子の系と比較し1/10程度であり、PomAのHisタグの位置の最適化を現在検討中である。尚、以上の取り組みは、小嶋誠司博士（名古屋大教授）、錦野達郎博士（大阪大特任研究員）、本間道夫博士（名古屋大名誉教授）、寺島浩行博士（長崎大助教）を研究協力者とし緊密な連携の下で推進した。錦野博士は、本知見も活用し、クライオ電顕単粒子解析によるPomAB複合体の構造解析に成功している。