変異型アクチンの試験管内バイオジェネシスとその分子機構の解析

点击翻译按钮获取中文摘要

本年度は、申請者が開発したヒト因子由来の再構成型タンパク質合成系を利用して、アクチンのN末端修飾がアクチンの重合反応（線維化）に与える影響を解析するための実験系の構築を行った。これまでの再構成型タンパク質合成系で利用していたC型肝炎ウイルス（HCV）由来のinternal ribosome entry site（IRES）を持つ発現ベクターでは、HCV IRES由来のアミノ酸配列（MSTNPKPQRKTGS）が目的タンパク質のN末端に付加されるため、N末端修飾の詳細な解析を行うことが出来なかった。そのため本実験では、HCV IRESをクリケット麻痺ウイルス（CrPV）由来のIRESに変更することで、アクチンのN末端を任意の配列から合成できるようにした。CrPV IRESではAlaが第一アミノ酸になると報告されており、このAlaにあたる塩基を、アクチンの第一アミノ酸にできるようにベクターを構築した。現在、上記の変更を施したヒト因子由来の再構成型タンパク質合成系で、アクチンのN末端をMDDD、RDDD、DDDの様に変化させたものを合成し、共焦点顕微鏡解析とHS-AFMによる重合の変化の様子と、質量分析によるN末端配列の解析を行っている。ヒト因子由来の再構成型のタンパク質合成系を利用した上記の実験は、in vitroで各種のアミノ酸修飾の意義を正確に解析するための基盤技術になると期待される。