Analysis of mechanism of DNA methylation changes in next-generation sperm genome induced by gestational arsenic exposure

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2022年度は、前精原細胞、A型精原細胞の単離法の条件について検討した。前精原細胞は、妊娠18日目のマウス胎児精巣から抗Thy1抗体が結合した磁気ビーズを用いてMSカラム（ミルテニーバイオテク社）により単離した。A型精原細胞は、生後6日目のマウス精巣から抗CD49f抗体が結合した磁気ビーズを用いてMSカラムにより単離した。次に、単離した細胞が、前精原細胞とA型精原細胞であることを確認するために、それぞれの細胞に特異的なThy1またはCD49fの遺伝子発現をリアルタイムPCRにより検討した。その結果、Thy1は前精原細胞画分で、CD49fはA型精原細胞画分で有意に発現が高いことが確認された。また、A型精原細胞で発現していると報告されているGfra1、Nanos2、Plzfが、今回単離したA型精原細胞画分で前精原細胞画分と比較して有意に発現が高いことがわかった。これらの結果から、抗Thy1抗体と抗CD49f抗体で単離した細胞は、それぞれ前精原細胞とA型精原細胞が大部分を占めていることが確認できたと考えている。次年度、妊娠8日～18日に85 ppmの亜ヒ酸ナトリウム (NaAsO2) を飲水投与したC3Hマウス (ヒ素群) 及び対照群から得た、妊娠18日目のマウス胎児精巣および生後6日目のマウス精巣を用いて、前精原細胞とA型精原細胞を単離し、網羅的なDNAメチル化解析を行う予定である。ヒ素曝露により世代を超えて継承される精子ゲノムメチル化変化部位の同定については、現在、追試も含めて、より詳細に解析中である。