Reconstitution of Physiologically Relevant 3D Blood-Brain Barrier Model for the Elucidation of its Selective Transport Mechanism

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本研究では，血液脳関門（blood-brain barrier, BBB）の構成細胞が直接的に相互作用しうるモデルを作製することにより生体内の血液脳関門のバリア機構を厳密に捉えたin vitroモデルを実現し，血液脳関門の選択的物質輸送のメカニズム解明を目指す．本年度は，独自技術である「マイクロメッシュ培養法」を駆使し，強固な密着結合を有する血管内皮細胞シートを作製し，そのバリア能を評価することを目指した．本法では，線幅が細く，開口部が広いことが特徴のメッシュ構造基板を用いて細胞－基板間接着を制限することにより，細胞間結合による細胞シート形成が誘導される．本実験では，血管内皮細胞の異種であるヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECs）やbrain microvascular endothelial cell line (hCMEC/D3)をメッシュ構造基板上に播種したところ，個々の細胞が自己組織化的にメッシュの隙間を埋め，5日間で均一なシートを形成した．また，経上皮電気抵抗（TEER）の計測により細胞間結合に由来するバリア能を経時的に評価した結果，シート形成過程および形成後のそれぞれの段階でTEER値の上昇が確認され，細胞シート形成とともに細胞間結合が強化されることが示唆された．さらに，播種から14日後に行った免疫染色により密着結合を担うOccludinやZO-1等のタンパク質の発現が確認された．なお，従来の多孔質膜上で得られた細胞レイヤーと比較し，本法で得られた細胞シートの方がTEER値が高いことも認められた．今後，血管内皮細胞シート上に直接周皮細胞を播種することで血管細胞と周皮細胞の共培養モデルを作製し，さらにマトリゲル包埋培養されたアストロサイトと組み合わせることで3次元共培養モデルを完成させ，構成細胞同士の物理的コンタクトの有無やそのバリア能への影響を調べる．