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脂質輸送型ABC蛋白質の分子構造と役割の解明

阐明脂质转运 ABC 蛋白的分子结构和作用

基本信息

批准号：
20H02912
负责人：
小段篤史
金额：
$ 11.48万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、ヒト由来の脂質輸送型ABCタンパク質を対象とし、クライオ電子顕微鏡による単粒子解析、生化学的解析、及び細胞生物学的解析などの多面的な解析により、脂質輸送型ABCタンパク質の作用機構と生理的役割を解明すること目的とする。ABCタンパク質は12－17 回膜貫通αへリックスをもつ蛋白質であり、特にABCA1は2261アミノ酸残基の大きな膜タンパク質である。そのため、機能を保持したまま大量に精製することは容易ではない。2021年度は、機能状態に近いABCA1立体構造を決定することを目指し、脂質ナノディスクへ再構成したABCA1試料を用いてクライオ電子顕微鏡によるデータ収集および単粒子解析を実施した。ヒトABCA1をヒト由来のFreeStyle 293細胞を用いた一過性発現系により発現させ、活性を保ち単分散性の高い状態で精製サンプルを取得し、精製ABCA1を脂質ナノディスクへ再構成した。試料を負染色解析することにより、単分散性が良好であることを確認した後、クライオ電子顕微鏡解析のためのグリッド作製を実施した。試料の溶液条件、タンパク質濃度、グリッドへのアプライ量、ろ紙によるブロット時間等、データ収集のために最適な条件を決定した。作製したグリッドを用いて、クライオ電子顕微鏡によるデータ収集を行い、単粒子解析を実施したところ、ABCA1粒子の二次元平均像さらには初期三次構造を得ることができた。現在、三次構造のさらなる精密化を行っており、今後、機能状態に近いABCA1立体構造を明らかにできると期待している。

は, this study ヒト origin の lipid transport type ABC タンパク qualitative を like と seaborne し, クライオ electronic 顕 micromirror による単 particle analytical, biochemistry analysis, parsing and び cell biology などの polyhedral な parsing により, lipid transport type ABC タンパク qualitative の role institutions cut をと physical service interpret すること purpose とする. ABC タンパク qualitative は 12-17 transmembrane alpha back へリックスをもつ protein であり, に ABCA1 は 2261 アミノ acid residues の big きな membrane タンパク qualitative である. そのため, function を keep したまま large に refined することは easy ではない. 2021 annual は, functional status に almost い ABCA1 three-dimensional structure を decided することを refers し, lipids ナノディスクへ reconstitution した ABCA1 sample を with いてクライオ electronic 顕 micromirror によるデータ収 set および単 particle analytical を be applied した. ヒト ABCA1 をヒト origin の FreeStyle 293 cells を using いた transient 発 now is により発 now させ, active を bartender ち単 dispersion state of high のいで refined サンプルを obtain し, refined ABCA1 を lipid ナノディスクへ reconstitution した. Sample を negative staining parsing することにより, good 単 dispersion がであることを confirm した, クライオ electronic 顕 micromirror parsing のためのグリッド cropping を be applied した. Sample の solution condition, タンパク mass concentration, グリッドへのアプライ quantity, ろ paper によるブロット time, データ収 set のため optimal な conditions にを decided した. Cropping したグリッドを with いて, クライオ electronic 顕 micromirror によるデータ収 row いを, 単 particle analytical を be applied したところ, ABCA1 particle の secondary yuan on average as さらには three tectonic を too early ることができた. Now, three tectonic のさらなる line motors をっており, in the future, functional status に nearly い ABCA1 three-dimensional structure を Ming らかにできると expect している.