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脂質輸送型ABC蛋白質の分子構造と役割の解明

阐明脂质转运 ABC 蛋白的分子结构和作用

基本信息

批准号：
20H02912
负责人：
小段篤史
金额：
$ 11.48万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、ヒト由来の脂質輸送型ABCタンパク質を対象とし、クライオ電子顕微鏡による単粒子解析、生化学的解析、及び細胞生物学的解析などの多面的な解析により、脂質輸送型ABCタンパク質の作用機構と生理的役割を解明すること目的とする。ABCタンパク質は12－17 回膜貫通αへリックスをもつ蛋白質であり、特にABCA1は2261アミノ酸残基の大きな膜タンパク質である。そのため、機能を保持したまま大量に精製することは容易ではない。2021年度は、機能状態に近いABCA1立体構造を決定することを目指し、脂質ナノディスクへ再構成したABCA1試料を用いてクライオ電子顕微鏡によるデータ収集および単粒子解析を実施した。ヒトABCA1をヒト由来のFreeStyle 293細胞を用いた一過性発現系により発現させ、活性を保ち単分散性の高い状態で精製サンプルを取得し、精製ABCA1を脂質ナノディスクへ再構成した。試料を負染色解析することにより、単分散性が良好であることを確認した後、クライオ電子顕微鏡解析のためのグリッド作製を実施した。試料の溶液条件、タンパク質濃度、グリッドへのアプライ量、ろ紙によるブロット時間等、データ収集のために最適な条件を決定した。作製したグリッドを用いて、クライオ電子顕微鏡によるデータ収集を行い、単粒子解析を実施したところ、ABCA1粒子の二次元平均像さらには初期三次構造を得ることができた。現在、三次構造のさらなる精密化を行っており、今後、機能状態に近いABCA1立体構造を明らかにできると期待している。

In this study, the reasons for this study are as follows: the analysis of ABC micro-particles, biochemical analysis, and cell biology analysis. The purpose of this study is to understand the physiological purpose of the mechanism of lipid delivery ABC. in this study, the origin of this study was derived from the analysis of ABC microparticles, biochemistry, and cell biology. The membrane was returned to the membrane by ABC, ABCA1, acid residue, acid residue and acid residue. It is easy to find out how to use a large number of precision equipment to maintain the ability of the machine. In the year 2021, the state of the machine and the status of the ABCA1 stereo machine will determine whether the target and fat will be converted into ABCA1 materials by the use of electrical and electronic microcomputers. The cause of the problem is that the FreeStyle 293 cell uses the information system to determine whether it is effective, active, dispersive, highly dispersive, accurate, accurate, sensitive, sensitive, stable, stable, stable, The material was dyed and dyed, and the dispersion was good. After confirming the temperature, the micro-analyzer of the computer was used to determine the temperature. The conditions of the solution, temperature, temperature, temperature and temperature, etc. In order to obtain the first three times in the first half of the cycle, the two-dimensional average image of ABCA1 particles was obtained by using the two-dimensional average image of the ABCA1 particles in the first three times. Now, three times to make the system more precise, and in the future, the status of the ABCA1 stereo system will make it clear that you are looking forward to it.