Multi-Dimensional (MD) digital assay for analysis of influenza virus heterogeneity

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今年度は、昨年度開発した多次元デジタル計測技術を、高機能酵素選抜に展開することを目標として研究に取り組んだ。結果として、酵素選抜系の基盤となるマイクロチャンバーへのDNAおよび酵素の固定技術と、固定した酵素の多次元計測技術を確立することに成功した。さらに実際の選抜を想定した実証で、多次元計測に基づき酵素変異体を判別することにも成功した。(1)　多次元デジタル計測技術の高機能酵素選抜への展開・昨年度開発した多次元デジタル計測技術を高機能酵素選抜に展開するため、まず選抜対象の酵素をコードしたDNAを一分子ずつチャンバー内に固定する技術を確立。・固定した一分子DNAから各チャンバー内で酵素を発現・チャンバーに固定することで、DNAとそこにコードされた酵素をチャンバー内で対応付ける手法を確立。・一分子DNAから発現させ固定したモデル酵素アルカリフォスファターゼ (ALP)について、阻害剤濃度を変化させながら繰り返し活性を計測し、IC50を決定することに成功。・実際の選抜を想定した実証として、大腸菌由来ALPの2種類の変異体DNAを混合してチャンバーに固定後、酵素を発現・各チャンバーに固定し、二つの阻害剤 (リン酸、バナジン酸)に対するIC50をDNA一分子ごとに決定した。そして二つのIC50に基づき2種類の変異体DNAを区別できるか検証した。その結果、2種類の変異体DNAを正しく区別できることが実証された。今後チャンバーからDNAを回収する手法を開発することで、これまでにない評価軸で高機能酵素を選抜できる系が確立できると期待される。