植物二次代謝産物の高効率生産に向けた革新的酵母代謝改変技術の開発

开发创新酵母代谢修饰技术，高效生产植物次生代谢产物

• 批准号: 20J15573
• 负责人: 三ツ井 良輔
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Osaka Prefecture University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-24 至 2022-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20J15573/
• 关键词: Saccharomyces cerevisiae; 植物二次代謝産物; 代謝工学; CRISPR-Cas

本研究では、医薬品や香料などの様々な用途があり産業的価値の高い植物二次代謝産物を高生産する組換え酵母を作製するために、グルコースから目的の植物二次代謝産物に至る多段階の代謝反応を改変する手法の開発を目指した。令和3年度は、前年度に検討した手法によるパチョロール生産酵母の作製を検討した。まず、解糖系から異種経路に至る24種類の代謝酵素遺伝子と15種類の異なるプロモーターを網羅的に組み合わせたDNA断片を作製した。そして、前年度に検討した手法により、作製したこれらDNA断片を酵母染色体の多数箇所に挿入することにより、標的代謝酵素の発現量がランダムに改変された多数の組換え酵母株を作製した。代謝改変を複数回行う場合、手法の特性上、代謝改変途中に標的遺伝子発現量が低下する場合があることが確認された。ただし、代謝改変時に、前の代謝改変の標的遺伝子を重複させることにより、遺伝子発現量の低下を抑制できることが示唆された。本研究で作製した組換え酵母においては、代謝改変後にピルビン酸以降の多数の代謝酵素遺伝子（PDC1、ERG10、ERG20など）の発現量が増加した一方、解糖系酵素遺伝子の発現量は増加しておらず、ピルビン酸以降の代謝反応が二次代謝産物生産に大きく寄与する可能性が示唆された。さらに計算シミュレーションにより、パチョロール生産量向上に寄与する複数の破壊候補を推定した。ただし、期間内に実際に破壊株を作製することはできなかった。また、本研究で作製した組換え酵母株を用いて回分培養を実施し、20 g/Lグルコースから25 mg/L-cultureを生産させることに成功した。さらに、流加培養によって同株のパチョロール生産量を2.6倍に増加させることに成功した。本代謝改変法は酵母における多段階の代謝を改変でき、今後、様々な多段階代謝経路の強化や律速経路の探索といった利用が期待できる。

The purpose of this study is to produce high-quality plant secondary metabolites, medicinal products, spices, and uses in the industry. Preparation of plant secondary metabolites, グルコースからに to るmulti-stage metabolic reaction の椉する technique の开発を目 Refers to した. In the 3rd year of Reiwa, the production method of yeast production in the previous year was the same.まず, glycolysis system, から heterogeneous 経路に to る24 types of metabolic enzymes, 15 types of のisoなるプロモーターをnetwork of に group み合わせたDNA fragments を した.そして, the previous year's に検たtechnique により, the production したこれらDNA fragments and the insertion of many yeast chromosomes The target metabolic enzymes are produced by using a large number of yeast strains and changing the amount of metabolic enzymes. In cases where metabolic changes occur multiple times, in terms of the characteristics of the technique, and when the amount of residual material that is targeted during metabolic changes is low, it is necessary to confirm the situation.ただし, metabolic change timeに, former metabolic change standard's remaining child を repeat させることにより, 缝子発発 in fact, the low level of restraint, できることがshows the instigation of された. In this study, we produced a quantitative analysis of the most metabolic enzyme residues (PDC1, ERG10, and ERG20), which were synthesized by replacing the yeast and the metabolically modified hydroxychloroquine acid.が加した一方, glycolytic enzyme 缝子の発综合 は Increase しておらず, ピルビン acid In order to reduce the metabolic reaction, the production of secondary metabolites and the possibility of secondary metabolite production are indicated. We calculate the production volume of シミュレーションにより and パチョロール to send upwards and the するplural number of broken candidates are estimated.ただし、During the period, the に実记に波壊区をproduced することはできなかった. In this study, the yeast strain was successfully produced by replacing the yeast strain with a sub-culture of 20 g/L and 25 mg/L-culture. The production volume of さらに and fed-batch culture によって of the same strain as のパチョロール has increased by 2.6 times, and させることに has been successful. This metabolic modification method is based on the multi-stage metabolism of yeast and the improvement of metabolism. In the future, the multi-stage metabolism of multi-stage metabolism will be strengthened and explored, and the utilization of multi-stage metabolism will be expected.