マウス原腸胚の三胚葉形成において遺伝子発現を制御するクロマチン構造変化の解明

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本研究では、マウス原腸胚における三胚葉形成について、クロマチン構造という観点から内胚葉、外胚葉、中胚葉それぞれで特異的なオープンクロマチン領域を同定することを目的とし、3つの課題に取り組んでいる。以下に令和4年度の研究実施状況を示す。１．三胚葉形成において各胚葉で特異的なオープンクロマチン領域の探索：前年度に引き続き、各々の胚葉を蛍光で識別可能なMIERUマウス(内胚葉マーカーSox17遺伝子にEGFP遺伝子が、外胚葉マーカーOtx2遺伝子にtdTomato遺伝子が、中胚葉マーカーT遺伝子にTagBFP遺伝子がそれぞれノックインされている）ES細胞から三胚葉可視化キメラマウス原腸胚を作製・発達させ、FACSにて胚葉特異的な細胞集団を分取した。上記で分取した細胞に対して、ATAC-seqのライブラリー作製の条件を検討した。しかし、ライブラリー作製の成功には至らなかった。２．各胚葉の特異的オープンクロマチン領域と遺伝子発現との相関の解析： 1.と同様に、EGFPタンパク質を利用したFACSにて分取した細胞で、三胚葉それぞれのマーカー遺伝子の発現を調べた。その結果、外胚葉および中胚葉のマーカー遺伝子の発現は内胚葉マーカー遺伝子よりも低い、あるいは発現が見られなかった。３．オープンクロマチン領域の破壊による胚葉形成異常の確認：クロマチン構造の形成に機能するYbx1遺伝子を破壊したマウス原腸胚にてクロマチン構造解析し、野生型と比較することで、各胚葉形成に重要なオープンクロマチン領域を絞り込めると考えた。MIERUマウスES細胞にCRISPR-Cas9を導入してYbx1-KO ES細胞を作製し、2.と同様にキメラ胚の作製・発達させてEGFPタンパク質を利用したFACSにて細胞を分取した。その後、次世代シーケンサーを用いたデータ取得し遺伝子発現を解析した結果、Ybx1のKOが確認できた。