複雑脳発生を明らかにする新規組み換え酵素ノックイン技術の開発

开发新型重组酶敲入技术以揭示复杂的大脑发育

• 批准号: 20K06464
• 负责人: 恒川 雄二
• 金额: $ 2.83万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K06464/
• 关键词: LsCre; AAV; Creノックイン; Cre de novo ノックイン; ノックイン; リコンビネース

今年度はLsCreを細胞およびマウスに投与するためAAVにパッケージングし、In vitro およびIn vivoでのLsCreのノックインを試みた。マウス大脳皮質にCas9発現カセット、Cre　レポーター（CAG-Flox-Stop-EGFP）カセット、gRNA発現カセットおよびドナー用LsCreを搭載したAAVを共導入し、In vivoでのノックインを試みた。その結果、Cas9を共導入しなかった場合でも、Cre　レポーターからEGFPの発現が確認され、プラスミドでは抑え込めていたLsCreのリークが何故かAAVでは抑え込めないことが新たにわかった。なぜ、プラスミドでは抑え込めていたLsCreのリークがAAVでは抑え込めないのかを明らかにするため、培養細胞にLsCreプラスミドを導入した群とLsCreAAVを感染させた群からmRNAを採取し、5'RACEを行い発現しているmRNAを確認した。その結果、LsCreAAVを感染させた群ではLsCre配列の上流にLsCreの配列が繰り返し確認された。これはAAVがエピソーマルに遺伝子を発現する場合ITRを介して環状のコンカテマーを形成することが原因を考えられ、この結果、LsCre上流にプラスミドではあらわれないプロモーター活性を持つ余分な配列が挿入されてしまったことによりリークが起こってしまっていることが確認された。

Our は LsCre を cells お よ び マ ウ ス に cast with す る た め AAV に パ ッ ケ ー ジ ン グ し, the In vitro お よ び In vivo で の LsCre の ノ ッ ク イ ン を try み た. Big マ ウ ス 脳 cortex に Cas9 発 now カ セ ッ ト, Cre レ ポ ー タ ー (the CAG - Flox - Stop - EGFP) カ セ ッ ト, gRNA 発 now カ セ ッ ト お よ び ド ナ ー with LsCre を carry し た AAV を total import し, In vivo で の ノ ッ ク イ ン を try み た. そ の results, Cas9 を total import し な か っ た occasions で も, Cre レ ポ ー タ ー か ら EGFP の 発 が now confirmed さ れ, プ ラ ス ミ ド で は え suppression 込 め て い た LsCre の リ ー ク が somehow か AAV で は え suppression 込 め な い こ と が new た に わ か っ た. な ぜ, プ ラ ス ミ ド で は え suppression 込 め て い た LsCre の リ ー ク が AAV で は え suppression 込 め な い の か を Ming ら か に す る た め, culture cell に LsCre プ ラ ス ミ ド を import し た group と LsCreAAV を infection さ せ た group か ら mRNA を し, 5 'RACE line を い 発 now し て い る mRNA を confirmation Youdaoplaceholder0 た. そ の results, LsCreAAV を infection さ せ た group で は LsCre match column の upper に LsCre の match column が Qiao り return し confirm さ れ た. こ れ は AAV が エ ピ ソ ー マ ル に posthumous son 伝 を 発 now す る occasions ITR を interface し て annular の コ ン カ テ マ ー を form す る こ と が reason を exam え ら れ, こ の results, LsCre high-class に プ ラ ス ミ ド で は あ ら わ れ な い プ ロ モ ー タ ー active な を hold over つ points with column が scions into さ れ て し ま っ た こ と に よ り リ ー ク が up こ っ Youdaoplaceholder0 まって まって る る とが とが confirm された.

项目成果

ウイルスの精製方法

病毒纯化方法

• 发表时间: 2022

Subcellular mRNA localization and local translation of Arhgap11a in radial glial progenitors regulates cortical development

• DOI: 10.1016/j.neuron.2023.02.023
• 发表时间: 2023-03-15
• 期刊: NEURON
• 影响因子: 16.2
• 作者: Pilaz，Louis-Jan;Liu，Jing;Silver，Debra L.
• 通讯作者: Silver，Debra L.