精子先体反応における膜融合制御機構の解明

精子の受精能獲得時に起こる先体反応では、精子頭部に存在する小胞 (先体) のエキソサイトーシスによりIZUMO1分子が露出し、受精可能となる。先体反応不全は不妊の原因の一つであると考えられており、先体反応の分子機構の解明は生物学・医学の双方の視点から重要である。しかしながら先体反応に必須な遺伝子は見つかっておらず、メカニズムも未解明である。申請者はノックアウトマウスを用いたスクリーニングにより、先体反応に関わる因子としてtFER1L3を新規に同定した。本研究ではtFER1L3の機能解析を通じ、先体反応のメカニズムを解明することを目的とした。そこで本年度は主に下記の2点について研究を遂行した。(1) 透過型電子顕微鏡を用いて精子の細胞膜/先体膜の観察を行った。従来法では、膜形態を保持しながら観察用のサンプルを調整することが困難であった。そのため今年度は、培養細胞で確立されている、サイトスピンを用いた方法について条件検討を行った。培養精子をサイトスピンを用いてカバーガラスに付着させ、固定・包埋することで、生細胞に近い膜構造を維持したサンプル作製に成功した。結果、tFer1l3欠損精子では先体反応直前に観察される、先体の膨らみは認められるものの膜の融合は起こらないことが明らかとなり、tFER1L3は膜融合のステップで機能することが示唆された。(2) tFER1L3の結合タンパク質を探索するために、tFER1L3のC末端にPAおよび1D4タグをタンデムに付加したタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを作製し、免疫沈降の条件を検討した。結果、PAタグ抗体が免疫沈降に有用であることを見出し、現在、質量分析等を用いた結合タンパク質の同定に向けて詳細な条件検討を行っている。

精子の受精能獲得時に起こる先体反応では、精子頭部に存在する小胞 (先体) のエキソサイトーシスによりIZUMO1分子が露出し、受精可能となる。先体反応不全は不妊の原因の一つであると考えられており、先体反応の分子機構の解明は生物学・医学の双方の視点から重要である。しかしながら先体反応に必須な遺伝子は見つかっておらず、メカニズムも未解明である。申請者はノックアウトマウスを用いたスクリーニングにより、先体反応に関わる因子としてtFER1L3を新規に同定した。本研究ではtFER1L3の機能解析を通じ、先体反応のメカニズムを解明することを目的とした。そこで本年度は主に下記の2点について研究を遂行した。(1) 透過型電子顕微鏡を用いて精子の細胞膜/先体膜の観察を行った。従来法では、膜形態を保持しながら観察用のサンプルを調整することが困難であった。そのため今年度は、培養細胞で確立されている、サイトスピンを用いた方法について条件検討を行った。培養精子をサイトスピンを用いてカバーガラスに付着させ、固定・包埋することで、生細胞に近い膜構造を維持したサンプル作製に成功した。結果、tFer1l3欠損精子では先体反応直前に観察される、先体の膨らみは認められるものの膜の融合は起こらないことが明らかとなり、tFER1L3は膜融合のステップで機能することが示唆された。(2) tFER1L3の結合タンパク質を探索するために、tFER1L3のC末端にPAおよび1D4タグをタンデムに付加したタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを作製し、免疫沈降の条件を検討した。結果、PAタグ抗体が免疫沈降に有用であることを見出し、現在、質量分析等を用いた結合タンパク質の同定に向けて詳細な条件検討を行っている。