オートファジー必須因子ＶＭＰ１のＸ線結晶構造解析

本研究はオートファジーの初期過程に必須であるVMP1の立体構造を明らかにすることで、VMP1のオートファジーへ果たす役割を解明することを目的としている。申請者は申請時点でVMP1単体およびパートナータンパク質であるTMEM41Bとの複合体の発現および精製に成功していた。申請以降、共同研究先とともにVMP1およびTMEM41Bが複合体を形成することを確かめた。この研究成果を含む内容はJ. Cell Biol.に掲載された。また、前年度ではVMP1およびTMEM41Bの複合体のクライオ電顕による単粒子解析を行い、予備的なデータを得ることに成功した。しかしながら、VMP1およびTMEM41Bの複合体は分子量が小さいうえに細胞外ドメインが小さいために、二者複合体ではクライオ電顕による残基レベルでの構造決定は困難であった。そこで、本年度はVMP1に特異的に結合する抗体を用いて、抗体、VMP1、TMEM41Bの三者複合体のクライオ電顕による構造解析を目指した。VMP1のモノクローナル抗体は市販されていないため、共同研究先とともに界面活性剤下でVMP1と安定して結合可能な抗体を選定した。今後この抗体、VMP1およびTMEM41Bの三者複合体の立体構造解析を目指し、精製条件の検討およびクライオ電顕による撮影を試みる。撮影に成功した場合は、VMP1およびTMEM41Bの機能の解明に向けて、機能および構造既知のタンパク質と構造比較を行い得られた仮説のもと機能解析を行う。

本研究はオートファジーの初期過程に必須であるVMP1の立体構造を明らかにすることで、VMP1のオートファジーへ果たす役割を解明することを目的としている。申請者は申請時点でVMP1単体およびパートナータンパク質であるTMEM41Bとの複合体の発現および精製に成功していた。申請以降、共同研究先とともにVMP1およびTMEM41Bが複合体を形成することを確かめた。この研究成果を含む内容はJ. Cell Biol.に掲載された。また、前年度ではVMP1およびTMEM41Bの複合体のクライオ電顕による単粒子解析を行い、予備的なデータを得ることに成功した。しかしながら、VMP1およびTMEM41Bの複合体は分子量が小さいうえに細胞外ドメインが小さいために、二者複合体ではクライオ電顕による残基レベルでの構造決定は困難であった。そこで、本年度はVMP1に特異的に結合する抗体を用いて、抗体、VMP1、TMEM41Bの三者複合体のクライオ電顕による構造解析を目指した。VMP1のモノクローナル抗体は市販されていないため、共同研究先とともに界面活性剤下でVMP1と安定して結合可能な抗体を選定した。今後この抗体、VMP1およびTMEM41Bの三者複合体の立体構造解析を目指し、精製条件の検討およびクライオ電顕による撮影を試みる。撮影に成功した場合は、VMP1およびTMEM41Bの機能の解明に向けて、機能および構造既知のタンパク質と構造比較を行い得られた仮説のもと機能解析を行う。