Differentiation of oxygen-tolerant nitrogen-fixing organ in the actinobacterium Frankia

窒素固定は大気中の窒素ガスからアンモニアを合成する反応であり、生態系への窒素養分の供給に重要な役割を担っている。窒素固定反応を行う酵素タンパク質は酸素によって損傷するので、多くの窒素固定細菌は低酸素環境で窒素固定を行う。Frankia属の放線菌は厚い外壁により酸素の流入を防ぐベシクルという構造体を発達させ、その内部で窒素固定酵素を発現するため、大気中でも窒素固定を行える。私たちはこれまでベシクルの発達が異常なFrankiaの変異体を多数単離している。本課題では、それらの特徴を詳しく調べて発達のどの段階に異常を持つかを知り、異常の原因となる遺伝子（変異原因遺伝子）を同定することを目指している。そのために、変異株の細胞集団の中から、DNA複製エラー等の２次的変異により窒素固定能が回復した回復細胞を単離培養する。回復株と元々の変異株のゲノム解析を行い、それらが持つ変異を比較することにより、回復株で復帰変異やサプレッサー変異が起きている遺伝子を特定する。本年度は、３種の変異株について回復株を２～３株単離培養し、それらの表現型を詳細に解析した。全ての回復株において、アンモニア欠乏培地での増殖、窒素固定活性、ベシクル形成数が変異株と比べて有意に高まっていた。一部の株においては、ベシクル外壁の発達が回復しており、ベシクル内酸素濃度も低下していることも確認できた。2種の変異株および5種の回復株のゲノム解析を行い、復帰変異とサプレッサー変異の起きた遺伝子の特定を試みた。変異原因遺伝子を特定するためには、形質転換法を確立することが大変重要である。コドン使用頻度とプロモーター配列をフランキアに最適化した人工的な抗生物質耐性遺伝子を広宿主域プラスミドに組み込み、エレクトロポレーション法によりフランキアの形質転換を試みた結果、予備的ながら遺伝子導入が起こっていることを示すデータが得られた。

窒素固定は大気中の窒素ガスからアンモニアを合成する反応であり、生態系への窒素養分の供給に重要な役割を担っている。窒素固定反応を行う酵素タンパク質は酸素によって損傷するので、多くの窒素固定細菌は低酸素環境で窒素固定を行う。Frankia属の放線菌は厚い外壁により酸素の流入を防ぐベシクルという構造体を発達させ、その内部で窒素固定酵素を発現するため、大気中でも窒素固定を行える。私たちはこれまでベシクルの発達が異常なFrankiaの変異体を多数単離している。本課題では、それらの特徴を詳しく調べて発達のどの段階に異常を持つかを知り、異常の原因となる遺伝子（変異原因遺伝子）を同定することを目指している。そのために、変異株の細胞集団の中から、DNA複製エラー等の２次的変異により窒素固定能が回復した回復細胞を単離培養する。回復株と元々の変異株のゲノム解析を行い、それらが持つ変異を比較することにより、回復株で復帰変異やサプレッサー変異が起きている遺伝子を特定する。本年度は、３種の変異株について回復株を２～３株単離培養し、それらの表現型を詳細に解析した。全ての回復株において、アンモニア欠乏培地での増殖、窒素固定活性、ベシクル形成数が変異株と比べて有意に高まっていた。一部の株においては、ベシクル外壁の発達が回復しており、ベシクル内酸素濃度も低下していることも確認できた。2種の変異株および5種の回復株のゲノム解析を行い、復帰変異とサプレッサー変異の起きた遺伝子の特定を試みた。変異原因遺伝子を特定するためには、形質転換法を確立することが大変重要である。コドン使用頻度とプロモーター配列をフランキアに最適化した人工的な抗生物質耐性遺伝子を広宿主域プラスミドに組み込み、エレクトロポレーション法によりフランキアの形質転換を試みた結果、予備的ながら遺伝子導入が起こっていることを示すデータが得られた。