Regulation mechanism of apoptosis-inducing death receptor localization allowing for survival in tumor cells

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リガンドであるTRAIL分子と、細胞膜上で結合して細胞死を誘導するDR5タンパク質が、TRAIL耐性腫瘍細胞内では細胞膜より核に大量に局在するこれまでの実験事実を元に、DR5の局在を制御して細胞膜での発現を高めて、腫瘍細胞に対して広く細胞死誘導を可能にする機能分子を探索する目的で、バーコード化された約6,500種類のヒトタンパク質に対する約55,000種類のshRNAを含む、ヒトゲノムワイドshRNAライブラリーのモジュール#2（標的遺伝子：疾患関連遺伝子、薬剤標的遺伝子）を用いた。HEK293Tで調整した偽ウイルス粒子を、単なるTRAIL低感受性HeLa細胞株ではなく、HeLa細胞株にdeath domain欠損GFP-DR5を予め遺伝子移入した細胞に感染させてshRNAを遺伝子導入した。shRNAの選択薬剤であるDoxycyclineとGFP-DR5の選択薬剤であるG418共存下で培養、細胞膜に発現するDR5をPacific blue標識抗体で蛍光標識し、shRNAと共に遺伝子導入したTagRFP発現細胞で且つGFP発現細胞の中で、親株の細胞よりも細胞膜のDR5発現が高い細胞集団（DR5 high）をFACSでソートした。初回ソートでDR5 highはわずか0.7%だったが、5回目のソートで約50%に濃縮された。この細胞集団のコントロールとして、同様に遺伝子導入を行い、TagRFP陽性細胞で細胞膜DR5の発現が低い約80%の細胞をソートした。これらの細胞をレーザー顕微鏡で観察すると、GFP-DR5の蛍光がDR5 high の細胞では核に観察されず、ER領域と細胞膜に極めて明るく検出された。 一方、コントロール細胞は、主に核にGFP-DR5が観察され、細胞質や細胞膜の発現は弱く、ER領域の集積は認められなかった。そこで、これら２種類の細胞集団の遺伝子受託解析を依頼する。