Functional analysis and applications of the glycine oxidase-like enzyme participating in the antibiotic biosynthesis

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昨年度の研究により抗生物質BD-12の生合成は、生合成中間体グリシノスリシンのグリシン側鎖のアミノ基にグリシンが縮合した後、脱炭酸反応が触媒されると推定した。しかし、その脱炭酸反応のメカニズムについては不明であったため、今年度は本反応を触媒するN-ホルムイミドイル基転移酵素（Orf 1）のより詳細な生化学実験およびX線結晶構造解析を行った。本酵素の生化学実験において、基質であるグリシンの消費量と生産物である過酸化水素の発生量を比較したところ、1モルのグリシンを消費した際に、2モルの過酸化水素を生成することが明らかになった。よって、本酵素は補酵素FADによる2回のグリシン酸化反応を伴うことが強く示唆された。また、安定同位体で標識されたグリシンを基質に用いた酵素反応の結果、本酵素はグリシンのα位の2つの水素を酸化しながらN-ホルムイミドイル化を触媒することが示された。一方、Orf 1の結晶化実験は難航していたため、海外渡航制度を利用してUniversity of British ColumbiaのKatherine Ryan 博士の研究室にて1年間、酵素のX線結晶構造解析に関する技術と知識の習得に励んだ。上記の経験をもとに、共同研究者の協力を得ながら再度Orf 1の結晶化を試みたところ、分解能2.4オングストロームを示すOrf 1の結晶が得られた。X線結晶構造解析の結果、FADを含む活性部位の同定に成功し、その近傍に存在するサブドメインが本酵素の触媒するグリシンの脱炭酸反応機構において重要であることが強く示唆された。