ラマン顕微鏡を用いた大腸菌表現型・遺伝子型リンクの理解へ向けて

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本研究課題ではラマン顕微鏡に適合したマイクロ流体デバイス中で灌流培養、ライブセルラマン計測、そしてFISHによる遺伝子型同定を組合し、多様な遺伝型を持つ細胞集団での高速フェノタイピングを目標としている。令和４年度では、組合せFISH法の開発を進めた。まず、哺乳類細胞での先行研究で設計されたバーコード配列をアラビノース誘導性プロモーター（PBAD）の下に組み込み、大腸菌BW25113株に導入した。この株に対してFISH法を試みたが、外来バーコード配列に対する大腸菌FISHのプロトコルがなかったため、まずは既存のFISH法などを参考に条件検討を進めた。その結果、single molecule FISHプロトコルを一部改変したものが最適であることがわかったものの、先述の株に対して実施したところPBADプロモーターの発現量の低さに由来すると考えられる微弱なFISHシグナルしか検出できなかった。そこで、PBADプロモーターの代わりに恒常的に高発現するT7プロモーターを使用し、JM109 (DE3)株に導入して同様のテストを行った。この株では明確に遺伝子型同定に使えるレベルのFISHシグナルを得ることに成功した。しかし、３セットのバーコード組合せの分離を試したところ、いくつかのバーコード配列において明確なシグナルの喪失が観察され、バーコード配列の中でも不適合なものがあることを示唆された。今後はこれらを拡張し、本課題の目標である多数の株でのラマンPhenotypingおよびFISH Genotypingを目指す。