アクノロジン生産完全再構成系による単機能反復型生合成反応の網羅的分子機構解明

使用完全重建的阿奇诺嗪生产系统全面阐明单功能重复生物合成反应的分子机制

• 批准号: 24651245
• 负责人: 市瀬 浩志
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Musashino University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012 至 2013
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-24651245/
• 关键词: 生合成; 再構成; ポリケタイド; 放線菌; 酵素; 発現制御; 再構成系

本研究は、多様な生理活性物質の生産者として放線菌に注目し、代表的ポリケタイド二次代謝産物アクノロジン(ACT)を取り上げ、その生合成に必要な20段階の酵素反応を試験管内で完全再構成することを基盤とする。諸反応中には、単機能型縮合酵素による反復的炭素鎖構築反応、酵素反応中間体の支持タンパク質からの遊離機構および基本骨格修飾反応における酵素基質認識、単機能型酵素による多段階反応の制等が含まれる。本研究では、ACT生合成再構成系を材料として、酵素学的解析、各種機器分析を用いた酵素反応の精密解析、タンパクモデリング法を含む情報科学的解析を駆使した上記問題の網羅的解明を目的とする。本年度の研究計画として、ACT基本骨格形成反応(反復的炭素鎖構築反応)の再構成系の構築を設定し、以下の成果を得た。ACTの基本骨格形成に必須のタンパク群、すなわちActtI-ORF1(ケト縮合酵素α)、ActII-ORF2(ケト縮合酵素β)、ActI-ORF3(アシルキャリアタンパク)、ActIII(ケト還元酵素)、sfp(フォスホパンテニルトランスフェラーゼ)、fabD(アシルトランスフェラーゼ)の発現を放線菌および大腸菌の宿主を用いて実施し、組換精製タンパクとして調製した。これらのタンパクを用い、マロニルCoAを基質としたin Vitroでの生合成反応の再構築を試みたところ、7段階のケト縮合反応を経て生成するオクタケタイド鎖の閉環生成物であるSEK4/SEK4bとともにオクタケタイド鎖の炭素9位還元後の閉鎖生成物であるmutactinの生成がHPLCおよびLC/MSで確認された。この結果は、ACT生合成に関わる炭素骨格形成反応に関わる単機能縮合酵素による反復的炭素鎖構築反応を再現したものであり、本年度の研究計画の一部を達成することができた。

In this study, we focused on the production of a variety of physiologically active substances, including the selection of secondary metabolites (ACT), and the complete reconstitution of 20-stage enzyme reactions necessary for their synthesis in the test tube. Among these reactions, repeated carbon locks in the reverse and single functional condensation enzymes are involved in the construction of enzymes, enzyme reaction intermediates, support systems, dissociation mechanisms, basic skeleton modification reactions, enzyme substrate recognition, and multi-stage reaction systems in the single functional enzymes. This study aims to analyze the material, enzyme, enzyme reaction, machine analysis, information science analysis, etc. of ACT biosynthesis and reconstruction system. This year's research plan, ACT basic framework formation reaction (repeated carbon lock construction reaction) and reconstruction system design, the following results were achieved. ActI-ORF 1(α), ActII-ORF 2(β), ActI-ORF 3(α), ActIII(β), sfp(sfp), fabD(fabD), which are essential for the formation of the basic framework of ACT, are used in the production of bacteria and host cells of Escherichia coli. SEK4/SEK4b and SEK4/SEK4b were identified by LC/MS HPLC as a closed loop product of the 7-stage condensation reaction after the formation of a closed loop product of the 7-stage condensation reaction after the formation of a closed loop product of the 7-stage condensation reaction after the formation of a closed loop product of the 7-stage condensation reaction. The results of this research are related to the synthesis of carbon skeleton, the formation of carbon skeleton, the replication of carbon lock, and the completion of part of this year's research plan.