Development of membrane-permeable oligo nucleotide and clarification of the uptake mechanism

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本年度は、当研究室で開発した膜透過性核酸MPON(Membrane Permeable OligoNucleotide)の (A) 細胞内動態観察 と (B) 新規膜透過性核酸の開発 に取り組んだ。MPONはアンチセンスDNAあるいはsiRNAなど標的遺伝子の発現抑制に用いられる核酸材料に対してジスルフィド修飾を施した化学修飾核酸を指す。(A)について、蛍光標識したMPONをヒト培養細胞であるHeLa細胞に投与し、共焦点蛍光顕微鏡を用いて観察したところ、一部の細胞において、細胞内で局所的に凝集している様が見られた。ここで用いた第一世代と呼称するMPONに付加した化学修飾基は高い疎水性を有しており、それが細胞内での核酸凝集を促している可能性が考えられた。凝集が見られた細胞は一部であったが、凝集によって、見かけの核酸濃度低下に伴う機能低下や細胞への悪影響が起こる可能性が危惧された。そのリスクを回避するために、疎水性を低下させた修飾基や、細胞内の還元的環境に応答して修飾が外れる脱離型の修飾基などを付加した、新しい膜透過性核酸の開発に取り組んだ (B)。疎水性を低下させた修飾基の開発について、候補として合成したいくつかの修飾核酸について、膜透過性効率および遺伝子抑制効果を評価した。効果を示す修飾核酸が得られつつある一方で、第一世代MPONを上回るものは未だ得られていないため、引き続き開発を進める。また、膜透過ののち細胞内で脱離するよう、開裂構造を挿入した修飾基を考案し合成した。細胞内の還元的環境で開裂するようなジスルフィドリンカーを挿入したものや、細胞内で不安定で切断されやすいRNA配列を挿入したものなどを合成しており、現在、膜透過効率、遺伝子抑制効果、脱離効率などの面で評価を進めている。