Study of differentiation mechanism of A1 astrocyte regulated by primary cilia signaling

当該年度は、一次繊毛特異的にGFP-APEXを発現するノックイン（KI）の樹立に成功し、本マウスを用いて初代アストロサイトにおける一次繊毛構成分子の同定を試みた。しかし、本KIマウスにおけるGFP-APEXの発現量が想定よりも低く、ホモの遺伝子型をもつマウスは胎生致死を示すこと、ヘテロの遺伝子型を示すマウス由来の細胞においては、ウエスタンブロットではGFP-APEXタンパク質の発現は確認できるものの、免疫染色法では検出限界以下のため一次繊毛特異的なGFPの蛍光が検出できなかった。本マウス由来細胞を用いた一次繊毛特異的なタンパク質発現解析はさらなる条件の確立が必須であると考えられたため、平行して一次繊毛を時期・組織特異的にノックアウトすることのできるコンディショナルノックアウト(cKO)マウス(IFT88 cKOマウス)を樹立し、表現型の解析を行った。野生型マウス由来グリア細胞をLPSで刺激するとA1アストロサイトの分化が促進される。一方、IFT88 cKOマウス由来グリア細胞をLPSで刺激しても、A1アストロサイトの分化は誘導されず、一次繊毛の形成がA1アストロサイトの分化に必要であることが示された。また、野生型マウスにLPSを腹腔投与すると、脳内におけるA1アストロサイトの数が増加し、マウス新規物体認識テストのスコアは未投与群に比べて有意に減少する。一方、IFT88 cKOマウスにLPSを腹腔投与しても、脳内A1アストロサイトの数は増加せず、新規物体認識テストのスコアも減少しなかった。この結果より、LPS投与による認知機能の低下は一次繊毛を介したA1アストロサイト分化誘導により生じることが示唆された。

当該年度は、一次繊毛特異的にGFP-APEXを発現するノックイン（KI）の樹立に成功し、本マウスを用いて初代アストロサイトにおける一次繊毛構成分子の同定を試みた。しかし、本KIマウスにおけるGFP-APEXの発現量が想定よりも低く、ホモの遺伝子型をもつマウスは胎生致死を示すこと、ヘテロの遺伝子型を示すマウス由来の細胞においては、ウエスタンブロットではGFP-APEXタンパク質の発現は確認できるものの、免疫染色法では検出限界以下のため一次繊毛特異的なGFPの蛍光が検出できなかった。本マウス由来細胞を用いた一次繊毛特異的なタンパク質発現解析はさらなる条件の確立が必須であると考えられたため、平行して一次繊毛を時期・組織特異的にノックアウトすることのできるコンディショナルノックアウト(cKO)マウス(IFT88 cKOマウス)を樹立し、表現型の解析を行った。野生型マウス由来グリア細胞をLPSで刺激するとA1アストロサイトの分化が促進される。一方、IFT88 cKOマウス由来グリア細胞をLPSで刺激しても、A1アストロサイトの分化は誘導されず、一次繊毛の形成がA1アストロサイトの分化に必要であることが示された。また、野生型マウスにLPSを腹腔投与すると、脳内におけるA1アストロサイトの数が増加し、マウス新規物体認識テストのスコアは未投与群に比べて有意に減少する。一方、IFT88 cKOマウスにLPSを腹腔投与しても、脳内A1アストロサイトの数は増加せず、新規物体認識テストのスコアも減少しなかった。この結果より、LPS投与による認知機能の低下は一次繊毛を介したA1アストロサイト分化誘導により生じることが示唆された。