肺癌に対する非ウイルス遺伝子改変CAR-T細胞を用いた新規治療法の開発

开发利用非病毒基因改造CAR-T细胞治疗肺癌的新方法

• 批准号: 21K15547
• 负责人: 三浦 健太郎
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Shinshu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K15547/
• 关键词: CAR-T細胞療法; 肺腺癌; CAR-T; 原発性肺癌

本年度は①フローサイトメトリーを用いた、肺腺癌細胞株における抗原Xの発現の確認、②X-CAR-T細胞作製系の確立、③抗原X高発現肺腺癌細胞株に対する、健常ドナー血液より精製した末梢血単核球から作製したX-CAR-T細胞のin vitro抗腫瘍効果について検証した。①フローサイトメトリーを用いた肺腺癌細胞株における抗原X発現の確認：当教室が保有する16種類の肺腺癌細胞株に対して、細胞表面における抗原Xの発現をフローサイトメトリーによって評価した。13種類に抗原Xの発現を認め、そのうち7種類は発現率90%であった。この7種類の中で、発現率99%以上の細胞株3種類を選定し共培養試験をおこなった。②X-CAR-T細胞作製系の確立：本研究では、抗原を認識する細胞外ドメインとして、生体に存在するリガンドを模したものを用いており、このリガンド型X-CAR-T細胞の作製系は、現在信州大学小児科教室において特許申請中である。非ウイルス遺伝子改変法であるpiggyBac法で作製したX-CAR-T細胞は、健常ドナー7人において、遺伝子導入後14日目の導入率が平均46%と安定した導入効率を認めた。③X-CAR-T細胞のIn vitro抗腫瘍効果の検証：3種類の肺腺癌細胞株に対して、X-CAR-T細胞のin vitro抗腫瘍効果を4日間の共培養の後にフローサイトメトリーで検証した。また、共培養開始後24時間時点で培養上清を採取し、IFN-γとIL-2濃度をELISA法によって測定した。3種類すべての細胞株に対して、X-CAR-T細胞は活性化T細胞と比較して有意に腫瘍の増殖を抑制し、IFN-γおよびIL-2も有意に高値であった。

This year, the following items were included: ① identification of antigen X in lung adenocarcinoma cell lines; ② establishment of X-CAR T cell lines; ③ identification of antigen X in lung adenocarcinoma cell lines with high antigen X expression; and ① identification of X-CAR T cells in vitro anti-tumor effect in healthy blood samples. 1. Identification of antigen X expression in lung adenocarcinoma cell lines: 16 types of lung adenocarcinoma cell lines were evaluated for antigen X expression on cell surfaces. 13 kinds of antigen X are detected, 7 kinds of antigen X are detected, and the detection rate is 90%. Among the 7 species, the survival rate was more than 99%, and the 3 species were selected for co-culture test. (2) Establishment of X-CAR-T cell system: This study aims at understanding the extracellular environment and the existence of antigens in vivo. The X-CAR-T cell system is currently under license application in the Department of Pediatrics, Shinshu University. X-CAR T cells were produced by piggyBac method in 7 healthy individuals, and the average introduction rate was 46% 14 days after gene introduction. (3) Identification of X-CAR T cells in vitro anti-tumor effect: identification of X-CAR T cells in vitro anti-tumor effect after 4 days of co-culture with 3 lung adenocarcinoma cell lines At 24 hours after the start of co-culture, culture supernatants were collected and IFN-γ and IL-2 concentrations were measured by ELISA. 3 types of cell lines, X-CAR T cells and activated T cells, intentionally inhibited proliferation, IFN-γ and IL-2 levels