外尿道括約筋におけるdecorinの機能解析と治療標的としての意義

まず、ヒト筋細胞不死化法（CyclinD1、CDK4、TERT遺伝子導入）にて不死化後、FACSにて横紋筋マーカーであるCD56陽性細胞を純化し、得た不死化ヒト外尿道括約筋細胞（US2KD）を使用した。US2KDにリポフェクション法にてdecorin遺伝子を導入してHygromycineBでselectionを行い過剰発現株（US2KD/DCN）を作成し、Growth testを施行した。また、US2KD/WTとUS2KD/DCNを分化誘導し、横紋筋分化マーカ―であるMyosin heavy chain（MHC）の発現をRT-PCRおよびWestern blotting法で比較した。Growth testでは、US2KD/DCNはUS2KD/WTと比較して有意に増加した。また、US2KD/DCNは分化誘導後、RT-PCRではUS2/DCNはUS2KD/WTと比較してMHC1の発現が有意に増加したが、MHC2の発現は減少していた。今後はUS2KDにおいてdecorinのノックダウン株を作成し、増殖分化過程における変化について検討する。現在少ない数ではあるが複数の個体から採取した外尿道括約筋をもとにそれぞれ長寿化を行っており、hTERTのみを遺伝子導入し長寿化したヒト外尿括約筋でも実験をすすめているところである。

まず、ヒト筋細胞不死化法（CyclinD1、CDK4、TERT遺伝子導入）にて不死化後、FACSにて横紋筋マーカーであるCD56陽性細胞を純化し、得た不死化ヒト外尿道括約筋細胞（US2KD）を使用した。US2KDにリポフェクション法にてdecorin遺伝子を導入してHygromycineBでselectionを行い過剰発現株（US2KD/DCN）を作成し、Growth testを施行した。また、US2KD/WTとUS2KD/DCNを分化誘導し、横紋筋分化マーカ―であるMyosin heavy chain（MHC）の発現をRT-PCRおよびWestern blotting法で比較した。Growth testでは、US2KD/DCNはUS2KD/WTと比較して有意に増加した。また、US2KD/DCNは分化誘導後、RT-PCRではUS2/DCNはUS2KD/WTと比較してMHC1の発現が有意に増加したが、MHC2の発現は減少していた。今後はUS2KDにおいてdecorinのノックダウン株を作成し、増殖分化過程における変化について検討する。現在少ない数ではあるが複数の個体から採取した外尿道括約筋をもとにそれぞれ長寿化を行っており、hTERTのみを遺伝子導入し長寿化したヒト外尿括約筋でも実験をすすめているところである。