CRISPR libraryを用いた卵巣癌プロモーター制御による新規治療法の検討

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卵巣癌細胞株であるOVSAHOにMYCのプロモーター領域と八放サンゴDendraに由来する蛍光タンパクを組み込んだベクターを導入し、MYCのプロモーター領域を発現するOVSAHO細胞を樹立した。この細胞はMYCが過剰発現すれば光照射により蛍光を発するように設計されている。この細胞に対してCRISPRLibraryを導入することにより、MYCが過剰発現していると予想される細胞をDendraの発光を用いてソーティングし、回収した。予備実験で用いたHEK細胞はsingle　cellで回収し、十分解析に耐えられたが、しかし、OVSAHOはクローニングが難しく、回収方法を変更しながら、解析できる細胞数までクローニングできる方法を模索した。ソーティングゲートを変更しながら、うまく回収できた細胞から抽出したDNAを用いて、組み込まれたgRNAの配列をサンガーシーケンスを用いて解析すると、いずれもMYCそのものであることが判明した。そこで、OVSAHOに導入するベクターのMYCのgRNAの配列に変異を加え、同様の実験を行ったが、それでもシーケンスの結果はMYCであった。改善策としてMYCのgRNAの配列部位を完全に欠失させたベクターを作成し、OVSAHOに導入した。この細胞を用いてプロモーターアッセイを行うと、MYCgRNAをインフェクションさせてもプロモーター活性が上昇しないことを確認した。そこで、この細胞に対してCRISPRLibraryを導入し、再度ソーティングを行い、細胞を回収した。回収した細胞の一部を用いて、gRNA領域のTOPOクローニングを行った後に、サンガーシーケンスにて導入されたｇRNAを確認したところ、複数個の分子が同定し得た。そのため、このサンプルに対して次世代シーケンスを行い、MYCの活性を挙げる分子の同定を予定している。