口腔扁平上皮癌における Notch 上 O-グルコース糖鎖修飾の役割の解析

Notch中O-葡萄糖糖基化在口腔鳞癌中的作用分析

• 批准号: 21K16929
• 负责人: 浦田 悠輔
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K16929/
• 关键词: Notchシグナル; O-グルコース; XXYLT1; 扁平上皮癌; O-グルコース糖鎖; キシロース

1. XXYLT1 ノックアウト (KO) 細胞の作製：Notchシグナルを遮断する γセクレターゼ阻害薬により細胞増殖が変化した 扁平上皮癌細胞株の選別口腔扁平上皮癌細胞株, SAS 細胞、HSC3 細胞において、設計した gRNA、GFP を組み込んだ cas9 ベクターを SAS 細胞、HSC 細胞にトランスフェクションし、BD FACS Melody Cell Sorter を用い てシングルセルソーティングした。ソーティングした細胞を培養し、増殖させた後シークエンスを確認し、XXYLT1 をノックアウト (KO) した細胞を既報通り作製した [Urata et al. 2020 Cells]。2.野生型、XXYLT1 KO 細胞における NOTCH1 活性化レベルの解析：　Notch シグナルの活性化は、細胞を用いたレポーターアッセイにより評価している。現在米国ベイラー医科大学に共同研究のため赴任し、GXYLT1、GXYLT2、および XXYLT1 をノックアウト (KO) したマウスより作出した線維芽細胞( MEF cells）を用いて実験系を確立させている。Notchリガンドである Jag1 を発現する細胞をシグナル送信細胞として、また、Notch と Notchシグナル応答性のルシフェラーゼ遺伝子を発現する細胞をシグナル受信細胞として用いており、まだ繰り返し検討が必要だが、GXYLT1、XXYLT1 KO にて Notch シグナルの変化が確認されてきている。3 XXYLT1 KO SAS細胞における糖鎖構造の解析：効率の良い Notch 細胞外ドメインの精製のため Notch1 強制発現の為のウイルスベクターを作成した。今後、Notch１ の精製を進め糖鎖構造を解析していく。

1. XXYLT1 (KO) Cell Production: Notch cell lines are selected for squamous cell carcinoma cell lines, SAS cells, HSC3 cells, design, gRNA, GFP, and cas9 cell lines are selected for SAS cells, HSC cells, and cell proliferation. BD FACS Melody Cell Sorter is used in cell sorting. Cell culture, proliferation, and identification [Urata et al. 2020 Cells] 2. Analysis of NOTCH1 activation in wild-type, XXYLT1 KO cells: Notch activation in cells Now, a practical system for the use of MEF cells has been established through joint research at the University of Medicine in the United States, including GXYLT1, GXYLT2, and XXYLT1. Notch and Jag1 cells producing Notch and Jag 1 cells. 3 XXYLT1 KO SAS cell sugar lock structure analysis: the efficiency of good Notch cell outside the refining of the Notch1 stress generation and for the creation of the Notch cell outside the Notch cell. In the future, Notch1 will be refined and analyzed.