口腔扁平上皮癌における Notch 上 O-グルコース糖鎖修飾の役割の解析

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1. XXYLT1 ノックアウト (KO) 細胞の作製：Notchシグナルを遮断する γセクレターゼ阻害薬により細胞増殖が変化した 扁平上皮癌細胞株の選別口腔扁平上皮癌細胞株, SAS 細胞、HSC3 細胞において、設計した gRNA、GFP を組み込んだ cas9 ベクターを SAS 細胞、HSC 細胞にトランスフェクションし、BD FACS Melody Cell Sorter を用い てシングルセルソーティングした。ソーティングした細胞を培養し、増殖させた後シークエンスを確認し、XXYLT1 をノックアウト (KO) した細胞を既報通り作製した [Urata et al. 2020 Cells]。2.野生型、XXYLT1 KO 細胞における NOTCH1 活性化レベルの解析：　Notch シグナルの活性化は、細胞を用いたレポーターアッセイにより評価している。現在米国ベイラー医科大学に共同研究のため赴任し、GXYLT1、GXYLT2、および XXYLT1 をノックアウト (KO) したマウスより作出した線維芽細胞( MEF cells）を用いて実験系を確立させている。Notchリガンドである Jag1 を発現する細胞をシグナル送信細胞として、また、Notch と Notchシグナル応答性のルシフェラーゼ遺伝子を発現する細胞をシグナル受信細胞として用いており、まだ繰り返し検討が必要だが、GXYLT1、XXYLT1 KO にて Notch シグナルの変化が確認されてきている。3 XXYLT1 KO SAS細胞における糖鎖構造の解析：効率の良い Notch 細胞外ドメインの精製のため Notch1 強制発現の為のウイルスベクターを作成した。今後、Notch１ の精製を進め糖鎖構造を解析していく。