Nager症候群の発症機序の解明と頭蓋顔面の形態形成不全の予防

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Nager症候群はスプライシング装置の異常により顎顔面部に形態異常が生じるスプライソソーム症の一つである。本疾患は四肢顔面骨形成不全症に分類され、小下顎、頬骨低形成、上肢橈側の低形成を特徴とし、一部患者には小頭症も認められる。本疾患の原因遺伝子はスプライシング因子Sf3b4であるが、近年、ヒト線維芽細胞においてSF3B4が核外に移行し、Ⅰ型コラーゲンの合成効率を上げていることが明らかになった。これを受けて、本研究ではまずNager症候群の原因の直接的な原因となっているスプライシング因子Sf3b4の分子機能の詳細を明らかにすることを目標とした。Sf3b4の骨形成への影響を検討するため、マウス骨芽細胞様細胞であるKUSA-A1細胞のSf3b4両アリルをゲノム編集により欠失させた。マウスSf3b4のエクソン2の一部をゲノム編集するためのベクターを設計し、KUSA-A1細胞にトランスフェクションにより導入した。ベクターに含まれるGFPの蛍光により導入細胞をフローサイトメトリーによる識別にて取得し、一細胞ずつに分離して培養した。8つの細胞株を得てゲノム編集サイトを確認したところ、塩基欠失や塩基挿入の変異により極端に短いタンパク質をコードするアリルのみを持つと考えられる２つのホモ変異株が得られた。これらの細胞株でSF3B4タンパク質の著明な減少が見られることをウエスタンブロッティング解析により確認した。これら２つの細胞株を石灰化誘導培地により長期培養した後にアリザリンレッド染色を行ったところSf3b4変異による石灰化能の変化はみられなかったが、Sf3b4 変異細胞株の細胞増殖能は著しく低下していた。現在は、これらのSf3b4変異細胞株でのⅠ型コラーゲンの合成能を解析するために、MS/MSによるⅠ型コラーゲンの合成量の計測を検討している。