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三次元NASHモデル細胞の確立とビタミンE同族体による効果の検討

三维NASH模型细胞的建立及维生素E同系物作用的考察

基本信息

批准号：
22K14845
负责人：
高橋知衣
金额：
$ 1.75万
依托单位：
Kitasato University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K14845/
关键词：
ビタミンE NAFLD スフェロイドトコトリエノール NASH

项目摘要

肝実質細胞であるHepG2細胞と肝星細胞であるLX-2を共培養させた系において、スフェロイドが形成され、かつ肝機能が維持される培養条件を検討した。三次元培養用の超低接着性96穴プレートに2種類の細胞を異なる比率、すなわちHepG2のみ（A）、HepG2：LX-2＝20：1（B）、10：1（C）、5：1（D）になるよう播種した。総細胞数は1×10^4cells/wellとした。スフェロイド面積および円形度を24および72時間後に測定した結果、24、72時間後ともにLX-2の比率が高いほどスフェロイド面積が低下した。一方で、播種比率の違いは円形度に影響を及ぼさなかった。また、肝機能の指標として培養上清中のアルブミン濃度を測定した結果、HepG2とLX-2の比率がC（10：1）またはD（5：1）であるときに、A（HepG2のみ）とB（20：1）よりもアルブミン濃度が有意に上昇したことから、星細胞との共培養により実質細胞の機能が向上することが示された。ヒト肝臓における星細胞の割合は約5％であることから、5：1よりも10：1の比率で実験を進めることが妥当と考えられた。続いて、最適培養日数を検討するため、 HepG2：LX-2＝10：1、細胞数1×10^4cells/well で播種し、1、3、5、7日培養したスフェロイドをパラフィン包埋し、細胞接着因子であるカドヘリンの免疫染色を行った。また3、5、7日培養した細胞を回収してウエスタンブロット（WB）法にてカドヘリンタンパク質発現量を測定した。免疫染色の結果、1、3、5日後は同程度の染色が見られたが、7日後は検出できなかった。WBの結果からも、7日よりも3、5日培養群の方がカドヘリンタンパク質を高発現していることが明らかとなった。以上の結果より、培養日数は3～5日間が望ましいと考えられる。

HepG2 cells and hepatic stellate cells were co-cultured to investigate the culture conditions for the formation and maintenance of liver function. The ultra-low adhesion 96 points for three-dimensional culture have different ratios of 2 kinds of cells, such as HepG2 (A), HepG2: LX-2 = 20:1 (B), 10:1 (C), 5:1 (D). Total cell count is 1 × 10^4 cells/well. After 24 hours and 72 hours, the ratio of LX-2 was high and low. A party, the planting ratio and the shape of the impact of the In addition, liver function indicators such as HepG2: LX-2 ratio C (10: 1), HepG2: LX-2 ratio D (5: 1), HepG2: LX-2 concentration B (20: 1), HepG2: LX-2 ratio C (10: 1), HepG2: LX-2 concentration B (20: 1), HepG2: LX-2 ratio C (10: 1), HepG2: LX-2 ratio A (10: 1), HepG2: LX-2 ratio B (20: 1), HepG2: LX-2 ratio C (10: 1), HepG2: LX-2 ratio B (20: 1), HepG2: LX-2 concentration B (20: 1), HepG2: LX-2 ratio C (10: 1), HepG2: LX-2: LX-2 ratio C (5: 1), HepG2: LX-2: LX-2 ratio B (20 The ratio of star cells to liver cells is about 5%, 5:1, 10:1. HepG2: LX-2 = 10:1, cell number 1 × 10^4 cells/well, seeding, 1, 3, 5, 7 days of culture, cell adhesion factor, and immunostaining. After 3, 5 and 7 days of culture, the cells were recovered and their quality was measured by WB method. The results of immunostaining showed that the same degree of staining was observed after 1, 3 and 5 days, and the same degree of staining was observed after 7 days. The results of WB culture were as follows: 1. The quality of WB culture was higher than that of WB culture on the 7th day and 3rd day. The above results show that the number of days of cultivation is 3~5 days.