三次元NASHモデル細胞の確立とビタミンE同族体による効果の検討

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肝実質細胞であるHepG2細胞と肝星細胞であるLX-2を共培養させた系において、スフェロイドが形成され、かつ肝機能が維持される培養条件を検討した。三次元培養用の超低接着性96穴プレートに2種類の細胞を異なる比率、すなわちHepG2のみ（A）、HepG2：LX-2＝20：1（B）、10：1（C）、5：1（D）になるよう播種した。総細胞数は1×10^4cells/wellとした。スフェロイド面積および円形度を24および72時間後に測定した結果、24、72時間後ともにLX-2の比率が高いほどスフェロイド面積が低下した。一方で、播種比率の違いは円形度に影響を及ぼさなかった。また、肝機能の指標として培養上清中のアルブミン濃度を測定した結果、HepG2とLX-2の比率がC（10：1）またはD（5：1）であるときに、A（HepG2のみ）とB（20：1）よりもアルブミン濃度が有意に上昇したことから、星細胞との共培養により実質細胞の機能が向上することが示された。ヒト肝臓における星細胞の割合は約5％であることから、5：1よりも10：1の比率で実験を進めることが妥当と考えられた。続いて、最適培養日数を検討するため、 HepG2：LX-2＝10：1、細胞数1×10^4cells/well で播種し、1、3、5、7日培養したスフェロイドをパラフィン包埋し、細胞接着因子であるカドヘリンの免疫染色を行った。また3、5、7日培養した細胞を回収してウエスタンブロット（WB）法にてカドヘリンタンパク質発現量を測定した。免疫染色の結果、1、3、5日後は同程度の染色が見られたが、7日後は検出できなかった。WBの結果からも、7日よりも3、5日培養群の方がカドヘリンタンパク質を高発現していることが明らかとなった。以上の結果より、培養日数は3～5日間が望ましいと考えられる。