Reconstruction of cartilage morphogenesis and growth using limb organoids and analysis on its cellular basis

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本研究は、ヒト・マウスの部位・種固有の四肢 形態形成を司る細胞メカニズムの解明を目的とし、全能性幹細胞を、位置情報を付与したうえで三次元的に培養し、四肢形態形成および成長を培養下で再現する実験系を世界ではじめて確立する。これまで、肢間充織から三次元的な軟骨形態形成を培養下で起こさせる実験系が存在しなかったため、初年度はまずマウス胚由来の肢間充織を使って、位置情報に応じた形態形成を再現する実験系の確立を行った。モルフォゲン存在下で三次元培養を行った結果、RA存在下では小さな球形を保って軟骨分化し、Fgf・Wnt存在下では複数の軟骨が放射状に分化・成長していくことがわかった。このとき、組織の形態変化を起こすための細胞の移動を記述するため、エレクトロポレーションで細胞の核をラベルし、インキュベータ型二光子顕微鏡を用いてライブイメージングを行った。そのうえで、四次元画像を解析し、細胞の移動を追跡した。この解析により、細胞塊がその対称性を破る仕組みを明らかにできた。また、Fgf・Wnt存在下で組織が伸長する分子メカニズムを調べるための足掛かりとして、PICと呼ばれる実験手法で組織の基部と先端部のトランスクリプトームを比較し、基部と先端部のマーカー遺伝子を同定した。一方、ヒトES細胞からの四肢の分化系においては、途中まで二次元で培養して途中で三次元培養に切り替えることで、側板中胚葉から上皮間充織転換を経て肢芽間充織様の細胞が生じる様子を再現することができた。今後は、マウス胚由来の肢間充織を使ったオルガノイドにおいて対称性が破れる仕組みに関する知見を活かして、ヒトES細胞由来の肢間充織を使っても四肢の組織伸長を再現する実験を行っていく。