ハコネサルオガセ再合成系を用いた地衣類の新たな共生メンバーと共生遺伝子の解明

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ハコネサルオガセ共生系を用いて地衣類が共生菌・共生藻・共生バクテリアの三者共生系であることを実験的に示すため2022年度は以下の条件検討を行なった。ハコネサルオガセに由来する共生バクテリアSphingomonas sp.は共生藻との混合培養によってのみ実験室での培養が可能である。培養時バクテリアは藻細胞の表面に局在し単独コロニーを形成しないが、GFPを発現する共生バクテリア株を作製するためには単独コロニーが必要となる。そこで、共生バクテリアが藻細胞から遊離する培養条件を検討し明らかにした。GFP発現株を作製した後は実験室条件下で共生菌、共生藻、共生バクテリアの混合培養によって共生体を再合成しバクテリアの局在を蛍光顕微鏡で観察する予定であるため、共生体を用いた試料作製の手順・条件を検討し調整した。また共生体の再合成実験の条件を再検討した結果、これまでより長期間共生体の培養が可能になり、さらに長期間培養した方がバクテリアを加えた場合と加えなかった場合で共生体の表面構造や長さなどの差が顕著になることが明らかになった。バクテリアを加えると表面を覆う皮層がより厚く均一になると考えられる。研究計画ではバクテリアを加えた場合と加えなかった場合で全トランスクリプトーム比較を行う予定であるため、リボソームRNA除去に必要となる共生菌、共生藻、共生バクテリアのrRNA配列と相補的なプローブ配列を作製した。また、現在24のscaffoldからなる共生バクテリアゲノムをより繋げるためOxford Nanopore社のMinIONを用いたロングリードシーケンスを行ない、高分子DNAの抽出方法を確立した。