リンパ管による生体局所の物質・水循環調節機構の解析

微小循環におけるリンパ管の物質取り込み機構を明らかにすることを目的に、令和四年度は、生きた動物を用いたリンパ管および物質動態の観察手法の構築をおこなった。まず、リンパ管特異的に蛍光蛋白質が発現するモデル動物(Vegfr3-Gap43-Venus BAC Tgマウス、Watanabe, 2019, PLoS One)を用いてリンパ管を可視化し、２光子励起顕微鏡による生体光イメージングを試みた。生体組織では傷害が生じると、血管透過性の亢進による組織圧の変動や免疫細胞の集積・過剰な活性化が起こり、正常なリンパ管機能を計測する事が困難となる。そのため、外科的手術が不要であり、非侵襲で観察が可能な耳介を観察部位として選択し、生きたままの動物でリンパ管を観察できることを確認した。次に、リンパ管を介した物質循環動態の直接計測を実施するために、蛍光トレーサーのリンパ管への取り込みをライブイメージングにより観察した。具体的には、蛍光トレーサー（TRITC-dextran等）を尾静脈注射によって血管内に注入した後に、血管の一部を光刺激によって傷害し人工的に間質への漏出を誘導、直後から２光子顕微鏡を用いたタイムラプス観察をおこなった。その結果、間質に漏出したトレーサーがリンパ管内腔に取り込まれる様子を経時的に観察することに成功した。さらに、取得した画像からトレーサーの蛍光強度変化を時空間的に解析することで、取り込み部位やリンパ流の方向等の推定も試みた。さらに、ライブイメージング終了後には免疫染色を実施し、生体観察をおこなった部位の細胞間接着構造や周皮細胞の有無を調べ、リンパ管の物質取り込み部位と構造的特徴との比較もおこなった。これらの生体イメージング及び免疫染色の結果を統合して理解することで、リンパ管の取り込み機構を明らかにできると考えられる。

微小循環におけるリンパ管の物質取り込み機構を明らかにすることを目的に、令和四年度は、生きた動物を用いたリンパ管および物質動態の観察手法の構築をおこなった。まず、リンパ管特異的に蛍光蛋白質が発現するモデル動物(Vegfr3-Gap43-Venus BAC Tgマウス、Watanabe, 2019, PLoS One)を用いてリンパ管を可視化し、２光子励起顕微鏡による生体光イメージングを試みた。生体組織では傷害が生じると、血管透過性の亢進による組織圧の変動や免疫細胞の集積・過剰な活性化が起こり、正常なリンパ管機能を計測する事が困難となる。そのため、外科的手術が不要であり、非侵襲で観察が可能な耳介を観察部位として選択し、生きたままの動物でリンパ管を観察できることを確認した。次に、リンパ管を介した物質循環動態の直接計測を実施するために、蛍光トレーサーのリンパ管への取り込みをライブイメージングにより観察した。具体的には、蛍光トレーサー（TRITC-dextran等）を尾静脈注射によって血管内に注入した後に、血管の一部を光刺激によって傷害し人工的に間質への漏出を誘導、直後から２光子顕微鏡を用いたタイムラプス観察をおこなった。その結果、間質に漏出したトレーサーがリンパ管内腔に取り込まれる様子を経時的に観察することに成功した。さらに、取得した画像からトレーサーの蛍光強度変化を時空間的に解析することで、取り込み部位やリンパ流の方向等の推定も試みた。さらに、ライブイメージング終了後には免疫染色を実施し、生体観察をおこなった部位の細胞間接着構造や周皮細胞の有無を調べ、リンパ管の物質取り込み部位と構造的特徴との比較もおこなった。これらの生体イメージング及び免疫染色の結果を統合して理解することで、リンパ管の取り込み機構を明らかにできると考えられる。