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尿中遊離糖の腫瘍マーカー探索と臨床応用に向けた定量法の確立

探索尿游离糖肿瘤标志物并建立临床应用定量方法

基本信息

批准号：
22K15700
负责人：
半澤健
金额：
$ 3万
依托单位：
Gifu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

以前に行った、がんにおける比較的小さな尿中遊離糖鎖の変化に関する研究に引き続いて、より大きな構造の糖鎖に着目した腫瘍マーカー候補の探索を進めた。これまでに、健常者においてごく微量あるいは検出限界以下のシアリル化された多分枝（3, 4本鎖）糖鎖が、がん患者において増加傾向を示すことを確認している。基本的な多分枝糖鎖に関しては、酵素・化学修飾処理により分枝とシアル酸の結合様式まで解析を進められている。一方、分枝に加えて末端部に伸長構造を有すると推定される糖鎖も検出されているが、現状は質量による組成のみが判明している。また、分析手法の改良に関する検討も行った。収率評価のための内部標準として添加するための糖鎖として、天然にはほぼ存在しないと考えられる単糖残基を部分構造として組み込み、かつ天然糖鎖と性質が類似した合成オリゴ糖を設計した。さらに、微量な糖鎖のLC/MS検出安定性を高めるための感度の向上実験も行った。結果として、水リッチな逆相HPLC/MS(/MS)において、元の流速と同程度の揮発性有機溶媒または元の流速の0.2～2%程度の揮発性弱酸をポストカラム添加することにより、カラムにおける糖鎖分離に影響を与えずにポジティブモードにおける糖鎖の感度を1.5～2.5倍程度増加させることができた。これによりスプレーの安定性も増したためMS/MS定量測定値の再現性も向上した。一方で、特にシアル酸残基を4つ以上有する糖鎖およびリン酸基を有する酸性糖鎖は、精製度を高めるための複数回のHPLC分離を行うと収率が大きく低下することを確認している。これらの糖鎖はHPLCのカラム・配管に金属イオン不純物を介して吸着しやすいとされ、これによりクロマトグラムのピーク形状が悪くなりやすく（感度が低い・キャリーオーバーしやすい）、したがって定量分析を進めていくうえで改善すべき課題と考えられた。

The research on the change of sugar chain in urine was carried out in the past. This is the first time that a patient has ever been diagnosed with a disease, and the second time that a patient has ever been diagnosed with a disease. Basic multi-branched sugar chain is related to enzyme and chemical modification, and the binding mode of branched sugar chain is analyzed. A square, branch, end, extension structure, estimation, quality, composition, identification The improvement of analytical methods is related to the study of operation. In addition to the internal criteria for evaluation, natural sugar residues exist and are partially structured and similar in nature to synthetic sugar residues. The LC/MS of trace amounts of sugar is stable and sensitive. The results showed that the flow rate of volatile organic solvent was 0.2~2% of the flow rate of volatile organic solvent, and the sensitivity of carbohydrate lock was increased by 1.5~2.5 times when weak acid was added. The stability and reproducibility of MS/MS quantitative determination are improved. A sugar chain and an acid chain are present at least 4 times in one direction, and the separation efficiency of the multiple cycles by HPLC is high and low. This is the first time that the sugar lock HPLC has been used for quantitative analysis of metal impurities.