On-site cancer diagnosis by high-sensitivity detection of genomic abnormalities in residual tumor samples

膵胆道系腫瘍の確定診断における細胞・組織診において、採取可能な細胞・組織量が少ないために検体不適正（insufficient material）と判定される場合がある。本研究では、膵腫瘍患者を対象に、実地臨床で適確・迅速・安価に運用可能なPCR遺伝子診断システムの構築を目的とする。先行研究で、生検等の生体試料から核酸精製行程をスキップし、微量核酸の絶対定量が可能なデジタルPCR装置を用い液滴への核酸封入によるKRAS変異の有無を簡易検出する方法を開発した（Water-burst法：特願20-192P）。2022年度は本法を改良し、蛍光強度を二次元に表示することでKRASのコドン12変異のうち頻度の高い3種類 (G12D, G12V, G12R)とGNASのコドン201変異2種類 (R201H, R201C) を合わせた5種類のマルチプレックス検出系、加えてKRASコドン12/13に関する頻度の低い5種類 (G12C, G13Dなど)を組み合わせたマルチプレックス検出系の２種類の多重解析技術を構築した。さらに複数のドライバー変異のhotspot変異検出のため領域特異的増幅（ターゲットエンリッチメント）は可能かを検証した結果、膵腫瘍疑いの患者から採取した生検検体等を試料に1ng以下の微量核酸においてもKRAS及びGNAS変異の同時検出と変異タイプの特定が可能なことが確認できた（J Mol Diagn 2023, in press）。2023年度は、反応系を高速化するためSso7d融合ポリメラーゼ等の酵素や反応パラメーターの見直しを行うと共に、癌抑制遺伝子を同時に検出可能な系へと発展させたい。

膵胆道系腫瘍の確定診断における細胞・組織診において、採取可能な細胞・組織量が少ないために検体不適正（insufficient material）と判定される場合がある。本研究では、膵腫瘍患者を対象に、実地臨床で適確・迅速・安価に運用可能なPCR遺伝子診断システムの構築を目的とする。先行研究で、生検等の生体試料から核酸精製行程をスキップし、微量核酸の絶対定量が可能なデジタルPCR装置を用い液滴への核酸封入によるKRAS変異の有無を簡易検出する方法を開発した（Water-burst法：特願20-192P）。2022年度は本法を改良し、蛍光強度を二次元に表示することでKRASのコドン12変異のうち頻度の高い3種類 (G12D, G12V, G12R)とGNASのコドン201変異2種類 (R201H, R201C) を合わせた5種類のマルチプレックス検出系、加えてKRASコドン12/13に関する頻度の低い5種類 (G12C, G13Dなど)を組み合わせたマルチプレックス検出系の２種類の多重解析技術を構築した。さらに複数のドライバー変異のhotspot変異検出のため領域特異的増幅（ターゲットエンリッチメント）は可能かを検証した結果、膵腫瘍疑いの患者から採取した生検検体等を試料に1ng以下の微量核酸においてもKRAS及びGNAS変異の同時検出と変異タイプの特定が可能なことが確認できた（J Mol Diagn 2023, in press）。2023年度は、反応系を高速化するためSso7d融合ポリメラーゼ等の酵素や反応パラメーターの見直しを行うと共に、癌抑制遺伝子を同時に検出可能な系へと発展させたい。