LIPHと縮毛症の新規原因遺伝子C3ORF52の関連性の解析

LIPH与卷发新致病基因C3ORF52的关系分析

• 批准号: 22K16282
• 负责人: 浅野 伸幸
• 金额: $ 2.08万
• 依托单位: Yamaguchi University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K16282/
• 关键词: 縮毛症; LIPH; C3ORF52; C末端; 先天性縮毛症; LIPH遺伝子; C3ORF52遺伝子

令和4年度は、研究計画書に従ってLIPHおよびC3ORF52の各種発現ベクターを作製した。まず、全長のLIPHとC末端にHA-tagを導入した全長のC3ORF52（C3ORF52-HA）を培養細胞（HEK293T）に過剰発現させ、抗HA抗体を用いて免疫沈降法を行った。沈降させた蛋白を、抗HA抗体および抗LIPH抗体を用いたwestern blot(WB）法で解析した結果、LIPHがC3ORF52-HAと極めて効率よく共沈することが示された。次に、LIPHのN末端、中間部分、C末端をそれぞれ発現させるベクター（各N末端にGFP-Flag-tagを導入）を用いて、C3ORF52-HAとの結合能を検討するために抗HA抗体を用いた免疫沈降法を行った。その後、抗HA抗体および抗Flag抗体を用いたWB法で解析した。その結果、LIPHのC末端のみがC3ORF52-HAと共沈することがわかった。続いて、C3ORF52のN末端とC末端をそれぞれ発現させるベクター（各N末端にGFP-Flag-tagを導入）を用いて、C末端にHA-tagを導入した全長のLIPH（LIPH-HA）との結合能を検討するために抗HA抗体を用いた免疫沈降法を行った。沈降させた蛋白を抗HA抗体および抗Flag抗体を用いたwestern blot(WB）法で解析した結果、C3ORF52のC末端のみがLIPH-HAと共沈することが判明した。以上の結果から、LIPHとC3ORF52は、それぞれのC末端領域を介して結合する性質を有することが明らかになった。さらに、培養細胞にC3ORF52-HAを過剰発現させた後に抗HA抗体を用いた蛍光免疫染色法を実施した結果、C3ORF52-HAは細胞膜に局在することが示された。本結果から、C3ORF52のC末端が細胞膜の外側に存在し、LIPHと結合していると考えられた。

In 2010 and 2014, the research plan was prepared by LIPH and C3ORF52. The full-length C3ORF52 (C3ORF52-HA) was introduced into HEK293T cells and anti-HA antibodies were detected by immunoprecipitation. Western blot(WB) was used to analyze the protein, anti-HA antibody and anti-LIPH antibody. The results showed that LIPH and C3 ORF52-HA were co-expressed. The binding energy of C3 ORF52-HA was studied by immunoprecipitation method. Anti-HA antibody and anti-Flag antibody were analyzed by WB method. As a result, the C-terminal region of LIPH is co-located with C3ORF52-HA. The binding energy of LIPH (LIPH-HA) was studied by immunoprecipitation method. The binding energy of LIPH (LIPH-HA) was studied by immunoprecipitation method. Western blot(WB) was used to analyze the anti-HA antibody and anti-Flag antibody, and the LIPH-HA co-precipitation of C3ORF52 was identified. The above results show that LIPH and C3ORF52 have different properties. In addition, C3 ORF52-HA was detected in cultured cells and then anti-HA antibody was detected by light immunostaining. The results showed that the C-terminal of C3ORF52 existed outside the cell membrane, and LIPH was bound to it.