LIPHと縮毛症の新規原因遺伝子C3ORF52の関連性の解析

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令和4年度は、研究計画書に従ってLIPHおよびC3ORF52の各種発現ベクターを作製した。まず、全長のLIPHとC末端にHA-tagを導入した全長のC3ORF52（C3ORF52-HA）を培養細胞（HEK293T）に過剰発現させ、抗HA抗体を用いて免疫沈降法を行った。沈降させた蛋白を、抗HA抗体および抗LIPH抗体を用いたwestern blot(WB）法で解析した結果、LIPHがC3ORF52-HAと極めて効率よく共沈することが示された。次に、LIPHのN末端、中間部分、C末端をそれぞれ発現させるベクター（各N末端にGFP-Flag-tagを導入）を用いて、C3ORF52-HAとの結合能を検討するために抗HA抗体を用いた免疫沈降法を行った。その後、抗HA抗体および抗Flag抗体を用いたWB法で解析した。その結果、LIPHのC末端のみがC3ORF52-HAと共沈することがわかった。続いて、C3ORF52のN末端とC末端をそれぞれ発現させるベクター（各N末端にGFP-Flag-tagを導入）を用いて、C末端にHA-tagを導入した全長のLIPH（LIPH-HA）との結合能を検討するために抗HA抗体を用いた免疫沈降法を行った。沈降させた蛋白を抗HA抗体および抗Flag抗体を用いたwestern blot(WB）法で解析した結果、C3ORF52のC末端のみがLIPH-HAと共沈することが判明した。以上の結果から、LIPHとC3ORF52は、それぞれのC末端領域を介して結合する性質を有することが明らかになった。さらに、培養細胞にC3ORF52-HAを過剰発現させた後に抗HA抗体を用いた蛍光免疫染色法を実施した結果、C3ORF52-HAは細胞膜に局在することが示された。本結果から、C3ORF52のC末端が細胞膜の外側に存在し、LIPHと結合していると考えられた。