転写因子FoxO1/PPARαを用いた選択的インスリン抵抗性の病態解明

点击翻译按钮获取中文摘要

本年度に打ち立てた目標は主にFoxO1とPPRAαの相互作用を明らかにすることである。まずFoxO1とPPARαの発現プラスミドを作成した。PPARαに対する良質な抗体が生産中止により入手できなくなってしまったため、N末端にDDK (Flag)を付着させ、FoxO1にはHAを付着させて作成した。ウェスタンブロットにより、これらのプラスミドのタンパク発現が各々の転写因子の分子量に相当する52kDaおよび80kDaにブロットされることを確認し、Luciferaseアッセイへと進めた。まず肝糖新生の律速酵素をコードする主要な制御遺伝子であるG6pcについて、先行研究で行ったFoxo1とPPARαのChIP-seqのデータから、両者が結合するPromoterおよびEnhancer領域を同定した。それらの配列を用いて、1) Promoter-pGL4.10, 2) Enhancer-pGL4.10, 3) Enhancer-Promoter-pGL4.10の3種類のLuciferase assay用プラスミドを作成した。これらに対して、各々のリガンドであるインスリン、遊離脂肪酸、WY14643の3種類を用いて刺激を行い、G6pcの発現変化を評価した。その結果、FoxO1とPPARαはG6pcの発現を相乗的に強めることが確認された。この効果はEnhancerのみでは認められず、EnhancerとPromoterが揃わなければ得られなかった。また、これらの実験とは別に、FoxO1とPPARαのダブルノックアウトマウスから肝臓組織を取得し、適切な条件を評価した上で、それらのサンプルをRNA-seqに回して、現在解析をしている最中である。次年度の目標である糖代謝特異的標的遺伝子群の同定に向けて着実に研究を進めている。