Development of new therapeutic strategy for treatment-resistant colorectal cancer by CRISPR genome-wide analysis

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①CRISPR-Cas9を用いて一度に多くの遺伝子編集を行うためには、レンチウイルス由来のsgRNAライブラリを用いることが重要である(ゲノムワイド編集)。当教室ではこれまで遺伝子編集の実績がなく、まずはCRISPR-Cas9での遺伝子編集実験を導入するにあたって、癌細胞培養ができる環境を整備すると共に、レンチウイルスを用いた実験が行えるような実験室が必要であった。そのために、今回共同研究することとなった基礎教室と連携し、P2実験室の環境を整備した。②実際に遺伝子編集研究を導入する前に、ゲノム編集ハンズオントレーニングに参加した(Thermo Fisher SCIENTIFIC)。CRISPR-Cas9を用いた３つの実験系(Plasmid、RNA、Protein)を用いての遺伝子編集の方法と、ノックアウトする遺伝子を決定するsgRNAのデザイン方法を学んだ。その後、HEK293細胞に対して、Plasmidベクターを用いてHPRT1遺伝子をノックアウトさせることに成功した。また、GFP遺伝子を導入したHEK293細胞に対し、CRISPR-Cas9を用いて1塩基挿入(ノックイン)を惹き起こし、BFP遺伝子に変異させることに成功した。③2023年2月に遺伝子組換え新規実験申請の許可を得た。当教室で行う癌細胞を用いた遺伝子編集実験の導入として、レンチウイルスを使用してVEGFA遺伝子をノックアウトさせるカスタムsgRNAを現在作成中である。作成したsgRNAを用いて、当教室で所有する大腸癌細胞(HCT116等)のVEGFA遺伝子をノックアウトさせる予定である。