ゲノム編集細胞におけるオフターゲット変異の高感度検出法ClAmp-seqの確立

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近年、CRISPR-Cas9などのゲノム編集技術によってゲノムDNAの配列を自由に変更することで、あらゆる遺伝性疾患の治療が可能になることが期待されている。しかしながら、標的配列と類似した配列を持つ部位で変異が起こるオフターゲット変異によるがん化等の有害事象が懸念されており、オフターゲット変異の予測・評価がゲノム編集を用いた遺伝子治療の安全性確保のために重要である。オフターゲット変異の評価は一般的に、標的配列と相同性の高いオフターゲット変異候補部位について、実際に細胞に作用させた際にそれらの部位に変異が起こっているかどうかを、当該部位を増幅して次世代シークエンシングを行う方法 (Amplicon-seq) により検出することで行われている。しかしながら、この方法による変異の検出感度は0.1%程度であり、より高感度な変異検出法の開発が望まれている。そこで本研究では、変異のない配列の増幅を選択的に阻害する修飾オリゴDNA（クランプDNA）を用いてAmplicon-seqを行う高感度検出法ClAmp-seq法を確立する。本年度は、変異のない配列の増幅を選択的に阻害するクランプDNAの設計について検討した。導入する修飾核酸の位置、数を変化させたクランプDNAを複数設計し、モデルDNAと、そこから1塩基欠失したDNA（CRISPR-Cas9により最も起こりやすい変異である欠失のうち、最も変異のない配列との区別がつけにくい）に対する増幅抑制効果の違いを定量的PCR法により検討した。その結果、修飾核酸の位置及び数に応じた増幅抑制効果の違いが観察され、1塩基の欠失を見分けることのできるクランプDNAを取得することができた。