酵素発生活性を保持した光化学系II複合体の結晶化とX線構造解析

光化学系II複合体は複合体は光エネルギーを利用し、水分解、酸素発生という生物にとって重要な反応を触媒している。この酸素発生のメカニズムを明らかにするためには、立体構造の解明は不可欠である。そこでこの複合体の結晶化とX線回折実験を行った。昨年度は、イネの葉より精製した光化学系II標品をハンギングドロップ蒸気拡散法により結晶化を行ったところ最大0.5mm×0.5mm×0.2mmの六角板状結晶が得られた。しかしこの結晶は、c軸に垂直な方向に繊維回折パターンがあり、また不規則ならせん構造をもっており、構造解析をすすめるには非常に困難であった。またこの結晶のSDS-PAGEを行ったところ、精製標品でみられた多数のサブユニットがみられず、プロテアーゼにより分解されていた。まず最初は結晶成長後に分解がおこっていると考え、結晶が得られると直ちに液体窒素中に保存し分解の抑制を試みた。低温下でのX線回折実験は、X線損傷を防ぐにも有効であり、同一の結晶で完全なデータを収集できる。抗凍結剤条件の検索を行ったところ30%グリセロール存在下で結晶の瞬間凍結に成功した。しかしながら回折実験の結果、5Aの回折点が確認されたが、室温での測定と同様に分解に由来すると思われる繊維回折と不規則ならせん構造が確認された。このことから複合体の分解は結晶成長後に起こっているのではなく精製後、少しずつ分解が始まっていると考えられる。そこでプロテアーゼインヒビターを加えた結晶化条件の検索を行った。精製標品に種々のプロテアーゼインヒビターを加え分解抑制の効果を検討したところ、5mM EDTA、2mM N-エチルマレイミド、3%ベンズアミジンが有効であった。このうちベンズアミジンを加えた標品から0.2mm×0.1mm×0.1mmの結晶が得られた。現在この結晶のX線回折実験を行っている。

光化学系II複合体は複合体は光エネルギーを利用し、水分解、酸素発生という生物にとって重要な反応を触媒している。この酸素発生のメカニズムを明らかにするためには、立体構造の解明は不可欠である。そこでこの複合体の結晶化とX線回折実験を行った。昨年度は、イネの葉より精製した光化学系II標品をハンギングドロップ蒸気拡散法により結晶化を行ったところ最大0.5mm×0.5mm×0.2mmの六角板状結晶が得られた。しかしこの結晶は、c軸に垂直な方向に繊維回折パターンがあり、また不規則ならせん構造をもっており、構造解析をすすめるには非常に困難であった。またこの結晶のSDS-PAGEを行ったところ、精製標品でみられた多数のサブユニットがみられず、プロテアーゼにより分解されていた。まず最初は結晶成長後に分解がおこっていると考え、結晶が得られると直ちに液体窒素中に保存し分解の抑制を試みた。低温下でのX線回折実験は、X線損傷を防ぐにも有効であり、同一の結晶で完全なデータを収集できる。抗凍結剤条件の検索を行ったところ30%グリセロール存在下で結晶の瞬間凍結に成功した。しかしながら回折実験の結果、5Aの回折点が確認されたが、室温での測定と同様に分解に由来すると思われる繊維回折と不規則ならせん構造が確認された。このことから複合体の分解は結晶成長後に起こっているのではなく精製後、少しずつ分解が始まっていると考えられる。そこでプロテアーゼインヒビターを加えた結晶化条件の検索を行った。精製標品に種々のプロテアーゼインヒビターを加え分解抑制の効果を検討したところ、5mM EDTA、2mM N-エチルマレイミド、3%ベンズアミジンが有効であった。このうちベンズアミジンを加えた標品から0.2mm×0.1mm×0.1mmの結晶が得られた。現在この結晶のX線回折実験を行っている。