単一細胞レベルでのカルシウム反応計測に基づくスクリーニングシステムの確立

研究の目的申請者の所属する研究室では、新規睡眠障害治療薬の開発を目指して、覚醒維持に不可欠な神経ペプチドであるオレキシンの受容体を標的とした創薬研究を行っている。これまで低分子化合物の評価にはオレキシン受容体の安定発現株(HEK293細胞等)の細胞内カルシウム上昇反応を指標としてきたが、一過性発現系での評価が可能であれば、同一細胞に複数の受容体を発現させた場合の反応を見ることができ、よりin vivoに近い条件で低分子化合物への応答を検討することができる。しかし、従来の方法では一過性発現系の細胞ごとに異なる細胞内カルシウム濃度の変化を検出できないこと、さらに細胞集団の平均細胞内カルシウム上昇が小さく、低分子化合物の活性を再現性良く評価できなかった。最近、研究室に導入されたIMACS(Functional Imaging Cell-sorting System)では、細胞個々の細胞内カルシウム変化を検出できることから、このシステムを利用した一過性発現系での細胞内カルシウム応答の検出方法の確立に思い至った。研究方法と成果1) 単一細胞レベルでのカルシウム反応条件の確立まず、オレキシン1型受容体(OX1R)のC末に赤色蛍光蛋白mCherryを連結させた発現ベクターと、オレキシン2型受容体(OX2R)に緑色蛍光蛋白GFPを連結させた発現ベクターを発現させた細胞を作成した。細胞ごとの各受容体発現は、mCherryおよびGFPの蛍光によって確認することができる。これらを用いて受容体を一過性発現させる細胞の種類や培養密度を検討し、安定的かつ再現性良く検出できる条件を決定した。さらに個々の細胞面積および蛍光強度とオレキシンにより引き起こされる細胞内カルシウム上昇反応の相関関係を調べ、より高感度のパラメータに最適化した。2) 受容体共発現系でのカルシウム反応の評価1)で確立した条件をもとに異なる蛍光ラベル体により標識したOX1R, OX2Rを共発現させた細胞を抽出し、それぞれ単独で発現させた場合の細胞内カルシウム上昇反応との比較を行った。

研究の目的申請者の所属する研究室では、新規睡眠障害治療薬の開発を目指して、覚醒維持に不可欠な神経ペプチドであるオレキシンの受容体を標的とした創薬研究を行っている。これまで低分子化合物の評価にはオレキシン受容体の安定発現株(HEK293細胞等)の細胞内カルシウム上昇反応を指標としてきたが、一過性発現系での評価が可能であれば、同一細胞に複数の受容体を発現させた場合の反応を見ることができ、よりin vivoに近い条件で低分子化合物への応答を検討することができる。しかし、従来の方法では一過性発現系の細胞ごとに異なる細胞内カルシウム濃度の変化を検出できないこと、さらに細胞集団の平均細胞内カルシウム上昇が小さく、低分子化合物の活性を再現性良く評価できなかった。最近、研究室に導入されたIMACS(Functional Imaging Cell-sorting System)では、細胞個々の細胞内カルシウム変化を検出できることから、このシステムを利用した一過性発現系での細胞内カルシウム応答の検出方法の確立に思い至った。研究方法と成果1) 単一細胞レベルでのカルシウム反応条件の確立まず、オレキシン1型受容体(OX1R)のC末に赤色蛍光蛋白mCherryを連結させた発現ベクターと、オレキシン2型受容体(OX2R)に緑色蛍光蛋白GFPを連結させた発現ベクターを発現させた細胞を作成した。細胞ごとの各受容体発現は、mCherryおよびGFPの蛍光によって確認することができる。これらを用いて受容体を一過性発現させる細胞の種類や培養密度を検討し、安定的かつ再現性良く検出できる条件を決定した。さらに個々の細胞面積および蛍光強度とオレキシンにより引き起こされる細胞内カルシウム上昇反応の相関関係を調べ、より高感度のパラメータに最適化した。2) 受容体共発現系でのカルシウム反応の評価1)で確立した条件をもとに異なる蛍光ラベル体により標識したOX1R, OX2Rを共発現させた細胞を抽出し、それぞれ単独で発現させた場合の細胞内カルシウム上昇反応との比較を行った。