CLEM法を用いたTRAIL受容体の細胞内局在解析法の開発

Tumor necrosis factor-ralated apoptosis-inducing ligand(TRAIL)受容体はそのリガンドであるTRAILと結合し、複合体を形成、集積することにより、がん細胞特異的にアポトーシスを誘導することが知られている。その機序は未だ不明な点は多いが、受容体の集積の仕方がアポトーシスの誘導に関係していることが示唆されている。本研究では、TRAIL受容体集積の様子を電子顕微鏡レベルで解析するための手法を開発することを目的としている。方法として、TRAIL受容体の細胞内局在を解析するため、TRAIL受容体のN末端側に蛍光顕微鏡と電子顕微鏡の両方で観察可能なタグであるminiSOGを結合させた遺伝子コンストラクトを作製した(miniSOGをタグとすることで、免疫電顕法では得られない通常電顕像に近い形態保持に優れた電顕像が得られると考えられる)。作製したコンストラクトをHEK細胞に遺伝子導入し、共焦点レーザー顕微鏡で観察可能であることを確認した。遺伝子導入し発現したタンパク質がTRAIL受容体の局在を正しく反映しているか確認するため、内在性のTRAIL受容体を免疫染色し比較、検証した結果、ほぼ同様に形質膜上に局在していることが確認できた。現在、レーザー顕微鏡で観察した領域をそのまま電子顕微鏡で観察する方法の検討を行っている。また、本研究の成果として、アポトーシス抵抗性を示す細胞として糖転移酵素のGalNAcT14をノックダウンした細胞では、TRAIL受容体がコントロール細胞とは異なる局在を示すことがわかった(2017年度生命科学系学会合同年次大会発表)。今後、これらの細胞と作製した遺伝子コンストラクトを用い、アポトーシス抵抗性とTRAIL受容体の局在の関係性を電子顕微鏡レベルで解析していく予定である。

Tumor necrosis factor-ralated apoptosis-inducing ligand(TRAIL)受容体はそのリガンドであるTRAILと結合し、複合体を形成、集積することにより、がん細胞特異的にアポトーシスを誘導することが知られている。その機序は未だ不明な点は多いが、受容体の集積の仕方がアポトーシスの誘導に関係していることが示唆されている。本研究では、TRAIL受容体集積の様子を電子顕微鏡レベルで解析するための手法を開発することを目的としている。方法として、TRAIL受容体の細胞内局在を解析するため、TRAIL受容体のN末端側に蛍光顕微鏡と電子顕微鏡の両方で観察可能なタグであるminiSOGを結合させた遺伝子コンストラクトを作製した(miniSOGをタグとすることで、免疫電顕法では得られない通常電顕像に近い形態保持に優れた電顕像が得られると考えられる)。作製したコンストラクトをHEK細胞に遺伝子導入し、共焦点レーザー顕微鏡で観察可能であることを確認した。遺伝子導入し発現したタンパク質がTRAIL受容体の局在を正しく反映しているか確認するため、内在性のTRAIL受容体を免疫染色し比較、検証した結果、ほぼ同様に形質膜上に局在していることが確認できた。現在、レーザー顕微鏡で観察した領域をそのまま電子顕微鏡で観察する方法の検討を行っている。また、本研究の成果として、アポトーシス抵抗性を示す細胞として糖転移酵素のGalNAcT14をノックダウンした細胞では、TRAIL受容体がコントロール細胞とは異なる局在を示すことがわかった(2017年度生命科学系学会合同年次大会発表)。今後、これらの細胞と作製した遺伝子コンストラクトを用い、アポトーシス抵抗性とTRAIL受容体の局在の関係性を電子顕微鏡レベルで解析していく予定である。